碳水化合物反應元件結合蛋白對L02細胞糖脂代謝的作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　 隨著我國經(jīng)濟飛速發(fā)展和人民生活水平的提高,肥胖和胰島素抵抗在人群中的發(fā)生頻率越來越高,由此導致的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)在人群中也呈逐年上升趨勢,嚴重威脅國民的健康水平和生活質(zhì)量。脂肪肝和糖尿病是最常見的伴發(fā)疾病之一,在高血糖的情況下,脂肪肝的發(fā)生率明顯增加,但目前關于高糖狀態(tài)下肝脂質(zhì)代謝異常的機制并不十分清楚,深入探討其機制,制

2、定有效的預防和治療措施顯得極為重要。2001年,Yamashita等[1]發(fā)現(xiàn)了一種與LPK基因啟動子上ChoRE序列結合的轉(zhuǎn)錄因子,命名為碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate response elementbinding protein,ChREBP)。ChREBP是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸鋅指(basic helix-loop-helix/leucinezipper,bHLH-ZIP)蛋白[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),

3、葡萄糖代謝產(chǎn)物通過ChREBP以獨立于胰島素信號途徑的方式來調(diào)節(jié)糖酵解和脂肪合成相關酶的基因表達,影響肝臟的脂肪沉積。本實驗利用高濃度葡萄糖體外培養(yǎng)人正常肝細胞株(LO2細胞),觀察肝細胞的脂肪沉積、ChREBP轉(zhuǎn)位以及LPK、FAS、LXRα、SREBP-lc表達的變化,首次從正常人肝細胞水平探討高糖對肝細胞脂質(zhì)沉積的影響及可能機制,為進一步尋找新的治療靶點奠定基礎。
　　 方法：
　　 1、人正常肝細胞株LO2細胞用

4、含10％胎牛盎清的1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)、傳代。
　　 2、根據(jù)文獻研究[11],實驗設立G1組(對照組,培養(yǎng)基中所含葡莓糖濃度為11mmol/L),G2組(葡萄糖濃度為18mmol/L)和(33組(葡萄糖濃度為25mmol/L)。
　　 3、TG含量測定及油紅O染色了解LO2細胞脂肪變程度;細胞免疫熒光觀察ChREBP的核轉(zhuǎn)位情況,RT-PCR方法檢測肝型丙酮酸激酶(liver-pyruvate kinase,LPK)

5、和固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-lc(sterolregulatory dement binding protein-lc,SREBP-lc)的mRNA表達,Western blot方法檢測脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)和肝x受體α(Liver X receptor alpha,LXRα)的蛋白表達。
　　 結果：
　　 1、成功建立高糖誘導LO2肝細胞脂肪變的細胞模型。隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度增加及

6、造模時間延長,肝細胞脂肪變程度加重。
　　 1)TG含量測定:高糖培養(yǎng)24小時,G2、G3組肝細胞內(nèi)的TG水平較對照組G1稍升高(1.51±0.52、1.91±0.53 vs1.28±0.44),差異無統(tǒng)計學意義(P=0.3573);高糖培養(yǎng)48小時, G2、G3組肝細胞內(nèi)TG水平明顯升高(3.18±0,25、6.62±0.95 vs1.32±0.28),與G1組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.0010和P=0.0008),提示

7、隨著葡萄糖濃度增加及作用時間的延長,細胞內(nèi)TG含量增加。
　　 2)油紅O染色顯示:G1組僅見少量橘紅色脂滴;G2、G3組肝細胞內(nèi)橘紅色脂滴較G1組細胞增多,隨著培養(yǎng)時間延長,脂滴增加更明顯。根據(jù)細胞內(nèi)TG含量測定及油紅O染色,G3組較G2組細胞脂變更明顯,故我們選擇葡萄糖濃度25mmol/l為高糖組觀察濃度,進行后繼實驗。
　　 2、各組細胞內(nèi)ChREBP的核轉(zhuǎn)位情況
　　 高糖刺激3小時ChREBP表達逐漸由

8、胞漿轉(zhuǎn)位至胞核,6-12小時達到高峰,轉(zhuǎn)位率約20%左右,24小時開始減少。對照組ChREBP主要表達在胞漿。
　　 3、兩組細胞內(nèi)LPK、SREBP-1c mRNA表達的變化
　　 與對照組比較,高糖組細胞隨著葡萄糖的刺激,LPK mRNA表達量增加,6h、12h、24h和36h分別為0.375±0.029 vs0.215±0.045(P=0.0066)、0.527±0.016 vs0.215±0.045(P=0.00

9、03)、0.413±0.064 vs0.215±0.045(P=0.0118)和0.306±0.025 vs0.215±0.045(p=0.0376),各時間點LPK mRNA表達量差異有統(tǒng)計學意義,LPKmRNA表達量于12小時達高峰,后逐漸降低;高糖組各時間點SREBP-1c mRNA表達量與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4、各組細胞內(nèi)FAS、LXRα蛋自表達的變化
　　 與對照組比較,高糖

10、組細胞24h、48h的FAS蛋白表達呈時間依賴增加,分別為0.375±0.025 vs0.258±0.019(P=0.0030)和0.524±0.021 vs0.258±0.019(P=0.0001).差異均有統(tǒng)計學意義;然而高糖組細胞24h、48h LXRα蛋白表達與對照組比較無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 1、葡萄糖可能通過其代謝產(chǎn)物經(jīng)ChREBP-LPK-FAS途徑誘導肝細胞脂肪