急性血糖波動導致心肌與主動脈損傷的機制研究.pdf

1、近年來的研究表明，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展不僅與持續(xù)血糖水平相關，而且與血糖的波動性密切相關，其中高血糖與心血管疾病的關系更是備受關注，在心血管疾病臨床診治工作中有25％-35％患者涉及糖代謝紊亂。有實驗發(fā)現，血糖波動是糖尿病心血管并發(fā)癥強烈的先兆表現，提示短暫的高血糖在糖尿病的血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著直接和重要的角色。波動性高血糖可顯著增加2型糖尿病的微血管病變和心血管死亡危險。但其中的機制尚不完全清楚，有研究表明氧化應激是所

2、有糖尿病并發(fā)癥損害發(fā)生的主要因素。氧化應激可激活轉錄因子核因子-κB(Nuclear factor-KB，NF-κB)的表達，促進白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達，其中NF-κB是傳遞氧化應激信號至關重要的轉錄因子，而IL-6，TNF-α又可誘導氧化應激的產生，由此形成氧化應激-炎癥-氧化應激的惡性循環(huán)，導致細胞損傷。細胞損傷的終

3、極表現就是細胞的死亡，而細胞死亡的方式主要有壞死和凋亡兩種。在像糖尿病這樣的慢性疾病中，凋亡與壞死相比可能起著更為重要的作用。心肌細胞是一種終末分化細胞，沒有再生增殖能力，長期凋亡使其數量逐漸減少會導致心臟泵功能降低直至心力衰竭，也使得心肌對其他損傷如缺血的耐受明顯減弱，而血管內皮細胞凋亡和內皮細胞的功能障礙密切相關，內皮細胞的功能障礙可導致動脈粥樣硬化的發(fā)生。因此，抗氧化治療治療，減輕氧化應激反應引起了眾多學者的關注。維生素C及維生素

4、E是目前最常用的抗氧化劑，但它們并不能有效地在組織或細胞內發(fā)揮作用，哪種抗氧化劑的效果更好，也是目前研究的熱點。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是傳統的祛痰劑（痰易凈），而且在臨床上已有廣泛應用，無明顯不良反應，近年發(fā)現NAC具有顯著的抗氧化作用。目前尚無關于急性血糖波動在體的動物模型。本研究采用給Wistar雄性大鼠間斷地從靜脈輸注50％葡萄糖溶液建立急性血糖波動性動物模型，探討血糖波動誘導的氧化應激及炎癥

5、反應對心血管的影響及其中機制，并進一步研究抗氧化劑NAC的應用是否能減輕氧化應激及炎癥反應。
　　 實驗材料及方法
　　 一、實驗動物
　　 選取健康雄性Wistar大鼠24只，體重280-330g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，清潔度Ⅰ級，隨機被分為4組，每組6只，分別為對照組、急性血糖波動組、NAC干預組1、NAC干預組2，常規(guī)飼料，自由飲水，溫度22±1℃，濕度50％左右，明/暗周期為12h。
　　

6、 二、建立急性波動性高血糖、NAC干預組大鼠動物模型
　　 大鼠適應實驗室環(huán)境3-5天后，用10％水合氯醛(按體重0.35 ml/100g)腹腔麻醉，然后進行頸部動靜脈插管術。右側頸靜脈導管延伸至右心房，左側頸動脈導管延伸至主動脈弓。兩側的導管均經皮下延續(xù)至背部然后外置，導管末端用金屬釘封閉。動脈置管用做采血，靜脈置管用做輸液。所有大鼠術后均恢復3天。然后進行輸液，①對照組（A組）予0.9％生理鹽水，定時檢測血糖使血糖維持在5

7、.5mmol/L左右;②急性血糖波動組（B組）予50％葡萄糖注射液間斷輸注，定時檢測血糖，使血糖在5.5mmol/L與20mmol/L之間波動，即血糖控制在5.5mmol/L左右持續(xù)1小時，然后血糖控制在20mmol/L左右持續(xù)1小時，如此循環(huán);③NAC干預組1（C組），輸入NAC（0.35mg·kg-1·min-1）及間斷輸入50％葡萄糖注射液，定時檢測血糖，使血糖在5.5mmol/L與20mmol/L之間波動，即血糖控制在5.5mm

8、ol/L左右持續(xù)1小時，然后血糖控制在20mmol/L左右持續(xù)1小時，如此循環(huán);④NAC干預組2（D組），輸入NAC（0.7mg·kg-1·min-1）及間斷輸入50％葡萄糖注射液，定時檢測血糖，使血糖在5.5mmol/L與20mmol/L之間波動，即血糖控制在5.5mmol/L左右持續(xù)1小時，然后血糖控制在20mmol/L左右持續(xù)1小時，如此循環(huán)。在實驗的0h、2h、14h、26h、46h、48h分別從動脈取血0.6ml，離心后取上清

9、以備用。對照組在輸注44小時給予50％葡萄糖注射液輸注，調整輸注速度，使血糖保持在20mmol/L左右至46小時，所有實驗大鼠輸液時間為48小時，在輸液結束后動物稱重，予10％水合氯醛按0.3ml/100g腹腔注射麻醉動物，固定于解剖臺，剪去胸部毛發(fā)，迅速打開胸腔，心內取血5ml，3000轉/分離心15分，取上清于-70℃保存?zhèn)溆?。留取心肌及主動脈標本。
　　 三、主要實驗方法
　　 1、采用葡萄糖氧化酶法測定血糖;比色

10、法檢測血清及組織勻漿中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，比色法檢測心肌及主動脈勻漿中一氧化氮(Nitricoxide，NO)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)活性。
　　 2、采用免疫組化技術觀察心肌細胞及主動脈中NF-κB表達、誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)及細胞間粘附因子-1(Intercellul

11、aradhesion molecule-1，ICAM-1)的表達。
　　 3、TUNEL法檢測細胞凋亡。
　　 4、采用RT-PCR技術檢測心肌及主動脈中IL-6mRNA、TNF-αmRNA的表達。
　　 5、采用Western blot雜交技術檢測心肌及主動脈中IκB激酶β(IκB kinase-β，IKKβ)、Bax、Bcl-2水平。
　　 結果：
　　 1、活體急性血糖波動動物模型建立成功:

12、在急性血糖波動組可見血糖在5.5mmol/L與20mmol/L之間波動，即血糖控制在5.5mmol/L左右持續(xù)1小時，然后血糖控制在20mmol/L左右持續(xù)1小時，如此循環(huán)48小時。
　　 2、急性血糖波動組的大鼠氧化應激水平明顯增加，主動脈中的氧化應激比心肌重，抗氧化劑應用后可改善氧化應激:①急性血糖波動組大鼠血清和心肌及主動脈勻漿中MDA水平較對照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預組1較急性血糖波動組顯著降低(P＜0.0

13、5)，但和對照組比較無顯著性差異，干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異，主動脈勻漿中MDA顯著高于心肌勻漿(P＜0.05);②急性血糖波動組大鼠心肌及主動脈勻漿中GSH-PX水平較對照組明顯降低（P＜0.05），NAC干預組1較急性血糖波動組顯著升高(P＜0.05)，但和對照組比較無顯著性差異，干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異，主動脈勻漿中GSH-PX水平顯著低于心肌勻漿（P＜0.05）;③急性血糖波動組大鼠心肌及主

14、動脈勻漿中NO水平較對照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預組1較急性血糖波動組顯著降低(P＜0.05)，但和對照組比較無顯著性差異，干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異，主動脈勻漿中NO顯著高于心肌勻漿(P＜0.05);④急性血糖波動組大鼠心肌及主動脈中iNOS相對表達量較對照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預組1較急性血糖波動組顯著降低(P＜0.05)，但和對照組比較無顯著性差異，干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著

15、性差異，主動脈中iNOS相對表達量顯著高于心肌(P＜0.05)。
　　 3、急性血糖波動組大鼠的炎癥因子水平明顯增加，主動脈中炎癥因子的表達比心肌增多，抗氧化劑應用后可使炎癥因子表達減少:①急性血糖波動組大鼠心肌及主動脈中IL-6mRNA及TNF-αmRNA相對表達量較對照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預組1較急性血糖波動組顯著降低(P＜0.05)，但和對照組比較無顯著性差異，干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異，

16、主動脈中IL-6mRNA及TNF-αmRNA相對表達量顯著高于心肌(P＜0.05);②急性血糖波動組大鼠心肌及主動脈中ICAM-1相對表達量較對照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預組1較急性血糖波動組顯著降低(P＜0.05)，但和對照組比較無顯著性差異，干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異，主動脈中ICAM-1相對表達量顯著高于心肌(P＜0.05)。
　　 4、四組大鼠NF-κB相對表達量比較:急性血糖波動組大鼠心肌

17、及主動脈中NF-κB相對表達量較對照組明顯增加(P＜0.05)，NAC干預組1較急性血糖波動組顯著降低(P＜0.05)，但和對照組比較無顯著性差異，干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異，主動脈中NF-κB相對表達量顯著高于心肌(P＜0.05)。
　　 5、四組大鼠心肌及主動脈中IKKβ含量的比較:急性血糖波動組大鼠心肌及主動脈中IKKβ含量較對照組明顯升高(P＜0.05)，NAC干預組1較急性血糖波動組顯著降低(P＜0.

18、05)，但和對照組比較無顯著性差異，干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異，主動脈中IKKβ含量顯著高于心肌(P＜0.05)。
　　 6、急性血糖波動組中心肌及主動脈中促凋亡蛋白表達增加，抑蛋白表達減少:急性血糖波動組大鼠心肌及主動脈組織中的Bax表達顯著高于對照組(P＜0.05);加入NAC干預后，可見干預組1及2的Bax表達明顯低于急性血糖波動組（P＜0.05），干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異。急性血糖波

19、動組大鼠心肌及主動脈中Bcl-2的表達顯著低于對照組(P＜0.05)，加入NAC干預后，可見干預組1及2的Bcl-2表達明顯高于急性血糖波動組（P＜0.05），干預組2與干預組1和對照組比較均無顯著性差異。急性血糖波動組可見心肌及主動脈內皮有凋亡細胞出現，而NAC干預組1、NAC干預組2及對照組均未見細胞凋亡。
　　 結論：
　　 1、急性血糖波動可誘導心肌細胞及主動脈內促凋亡基因蛋白表達增加:抑凋亡蛋白表達減少，導致心

20、肌細胞及主動脈內皮細胞凋亡，小劑量或大劑量NAC干預后促凋亡蛋白表達明顯降低，抑凋亡蛋白表達明顯增加，未檢測到凋亡，小劑量或大劑量NAC之間無差異。
　　 2、急性血糖波動導致大鼠心肌及主動脈中氧化應激增強，IKKβ表達增多，啟動NF-κB信號通路，炎癥因子表達明顯增加，NAC干預后可抑制氧化應激，抑制通路的激活，減少炎癥因子的表達，但加大NAC干預劑量未見與低劑量組有差異。
　　 3、急性血糖波動在主動脈中誘導的氧化應