雷公藤紅素對(duì)破骨細(xì)胞及膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠中趨化因子CXCL2表達(dá)的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　探討雷公藤紅素(Celastrol，Cel)對(duì)小鼠骨髓誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化及膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠(CIA)模型局部關(guān)節(jié)炎癥及骨侵蝕的影響，以及Cel對(duì)破骨細(xì)胞分化過程中及CIA小鼠中趨化因子CXCL2表達(dá)的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　采用骨髓誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的方法培養(yǎng)破骨細(xì)胞，檢測破骨細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)及Cel對(duì)破骨細(xì)胞中CXCL2表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)包括:1.取小鼠骨髓細(xì)胞，加入MCSF

2、及RANKL細(xì)胞因子誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞;2.通過CCK8法測定Cel對(duì)骨髓細(xì)胞活性的影響，確定不影響細(xì)胞活性的安全濃度范圍;3.通過抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色觀察Cel對(duì)破骨細(xì)胞的影響;4.熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)檢測相關(guān)趨化因子，如CXCL2、CXCL9、CXCL11的相對(duì)表達(dá)量及Cel對(duì)趨化因子表達(dá)的影響。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　建立膠原CIA小鼠模型，檢測Cel對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥的作用并

3、探討相關(guān)趨化因子與骨侵蝕的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)包括:1.建立CIA模型，觀察小鼠體征并記錄小鼠的體重變化;2.根據(jù)小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分;3.通過HE染色等病理學(xué)方法觀察Cel對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)的炎癥及骨侵蝕的作用;4.通過小鼠關(guān)節(jié)Micro-CT三維重建及關(guān)節(jié)中TRAP的表達(dá)，直觀觀察Cel對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)破壞及體內(nèi)破骨細(xì)胞分化及功能的影響;5.通過ELISA方法檢測Cel對(duì)CIA小鼠血清中CXCL2的影響;6.通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Re

4、al-time PCR)檢測Cel對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)CXCL2及其受體的表達(dá)影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
　　通過CCK8法測定結(jié)果顯示，Cel濃度為1μ M、2μ M，5μ M時(shí)，明顯影響小鼠骨髓細(xì)胞的活性，而Cel濃度為0.1μ M、0.25μ M及0.5μ M時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，因此選用0.1μ M、0.25μ M、0.5μ M三個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn);通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察其細(xì)胞胞

5、體大、形態(tài)不規(guī)則、酶活性部分（胞質(zhì)）呈轉(zhuǎn)紅色、多核（大于等于3核）的巨噬細(xì)胞為破骨細(xì)胞，Cel對(duì)破骨細(xì)胞的形成有明顯抑制作用，且成濃度依賴性;熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示:CXCL2在破骨細(xì)胞中表達(dá)升高，Cel能夠明顯抑制破骨細(xì)胞形成過程中CXCL2的表達(dá)，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　根據(jù)關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，Cel組關(guān)節(jié)炎評(píng)分較膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎組降低明顯(P＜0.01)，提示Cel能夠明顯抑制CIA

6、小鼠關(guān)節(jié)的腫脹;HE染色結(jié)果顯示，Cel能明顯減少關(guān)節(jié)周圍炎性細(xì)胞浸潤及關(guān)節(jié)破壞;Micro-CT及關(guān)節(jié)TRAP染色結(jié)果顯示，Cel能夠有效抑制CIA小鼠關(guān)節(jié)中破骨細(xì)胞的數(shù)量和骨侵蝕程度。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CIA組小鼠血清中CXCL2表達(dá)相對(duì)于空白對(duì)照組升高，Cel能顯著抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠血清中CXCL2的表達(dá)(P=0.0003)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，CIA組小鼠關(guān)節(jié)中CXCL2及CXCR2的表達(dá)均升高，其中CXCL2

7、的表達(dá)升高更為明顯(P＜0.0161)，Cel能顯著抑制關(guān)節(jié)中CXCL2及其受體的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.趨化因子CXCL2在破骨細(xì)胞形成的過程中高表達(dá)，提示CXCL2可能在破骨形成的階段發(fā)揮作用;2.Cel能夠抑制小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成及分化;3.趨化因子CXCL2在CIA小鼠中高表達(dá)，可能參與了骨侵蝕的過程;4.Cel能夠抑制CIA小鼠關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)及骨侵蝕;5.Cel可能通過下調(diào)趨化因子CXCL2及其受體的