膠原誘導的關節(jié)炎小鼠血漿microRNAs表達分析.pdf

1、目的:
　　類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節(jié)組織慢性炎癥、骨及軟骨破壞為主要表現的全身性自身免疫性疾病。近年來研究發(fā)現miRNAs（microRNAs）與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關，循環(huán)miRNAs(circulating miRNAs)作為RA診斷標記物具有重要的潛在價值。本課題組前期在RA患者血漿中篩選得到9種差異性表達的miRNAs，本文進一步檢測這些差異性表達的miRNAs在膠原誘導的

2、關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠血漿中變化并探討血漿miRNAs的可能來源，從而為研究循環(huán)miRNAs在RA發(fā)病過程中的作用提供理論依據。
　　方法:
　　(1)使用牛Ⅱ型膠原和佐劑免疫DBA/1J小鼠建立CIA模型，采用實時熒光定量PCR(quantitative Real-time fluorescent PCR，qRT-PCR)檢測CIA小鼠及正常對照小鼠血漿和外周血單個核細胞

3、(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表達水平。
　　(2)分離CIA及正常小鼠PBMC，分別采用100 ng/ml LPS及2.5μg/ml PHA體外刺激培養(yǎng)1h和2h。應用qRT-PCR檢測培養(yǎng)細胞和上清中miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表達水平。
　　(3)采

4、用流式細胞術(flow cytometry，FCM)分選CIA及正常對照小鼠外周血、脾臟、淋巴結CD4+T、CD8+T細胞，采用實時熒光定量PCR檢測CD4+T、CD8+T細胞中miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表達水平。
　　結果:
　　(1)與正常DBA/1J小鼠相比，CIA小鼠血漿miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表達水平均顯著增高（P均＜

5、0.05）。
　　(2)CIA小鼠PBMC中miR-181d表達水平高于正常對照小鼠(P＜0.05)，但miR-9、miR-122-3p及miR-342-3p的表達水平二者無統(tǒng)計學差異(P均＞0.05)。
　　(3)與相應空白對照組相比，LPS刺激后的小鼠PBMC及培養(yǎng)上清中miR-9、 miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表達水平未見明顯改變(P均＞0.05)。PHA刺激雖未改變小鼠PBMC和培養(yǎng)

6、上清中miR-9、miR-122-3p及miR-342-3p的表達水平（P均＞0.05），但能顯著上調培養(yǎng)細胞和上清中miR-181d表達水平，且PHA刺激的CIA小鼠PBMC和培養(yǎng)上清中miR-181d的表達水平明顯高于相應刺激的正常對照小鼠（P＜0.05）。
　　(4)與正常對照相比，CIA小鼠外周血CD4+T細胞中miR-181d的表達水平無明顯差異(P＞0.05)，外周血CD8+T細胞中miR-181d的表達水平雖有升高趨

7、勢，但無統(tǒng)計學差異（P=0.07）;CIA外周血CD4+T、CD8+T細胞中miR-9、miR-122-3p、及miR-342-3p的表達水平均無明顯差異(P＞0.05)。
　　(5)CIA淋巴結CD4+T、CD8+T細胞中miR-181d的表達水平與正常相比無明顯差異(P＞0.05)，但CD4+T細胞中miR-342-3p的表達升高，而miR-9及miR-122-3p的表達水平降低（P均＜0.05）;CD8+T細胞中miR-12

8、2-3p的表達水平也降低(P＜0.05)。
　　(6)與正常對照相比，CIA小鼠脾臟CD4+T、CD8+T細胞中miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表達水平均無明顯差異（P均＞0.05）。
　　結論:
　　1、從RA患者外周血中篩選得到的四種差異性表達的miRNAs在關節(jié)炎小鼠模型中也發(fā)生特征性改變，但二者結果不完全一致。
　　2、miR-181d在CIA小鼠血漿、PBMC以