心臟成纖維細胞中NLRP3炎癥小體對新生乳鼠心肌細胞體外增殖能力的影響及機制研究.pdf

1、心肌病、冠心病、風濕性心臟病等心臟疾病的主要病理特征為功能性心肌細胞數(shù)量缺失。對于心臟再生增殖和心肌損傷修復的研究、哺乳動物心肌細胞的體外培養(yǎng)方法和再生增殖特征的研究，以及炎性條件下心肌中炎癥小體的產(chǎn)生，尤其是NLRP3炎癥小體對心肌細胞增殖修復的影響為當前關(guān)注的熱點。
　　本研究采用新生C57 BL/6乳鼠心臟細胞和心臟成纖維細胞體外原代共培養(yǎng)方法，研究不同日齡乳鼠心肌細胞的體外增殖特征，并通過構(gòu)建體外炎癥模型觀察NLRP3炎癥

2、小體對心肌細胞體外增殖的影響。該課題研究在進化、發(fā)展和再生生物學領域具有深遠的意義，同時對嬰幼兒心臟疾病以及由炎癥引起的青少年心肌炎患者的治療具有重要的指導作用。文中從以下幾方面進行論述：
　　一、新生乳鼠心臟細胞體外共培養(yǎng)體系的建立及其在心肌細胞體外增殖研究中的應用
　　目的:建立新生C57 BL/6乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞體外原代培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系，研究不同日齡的新生C57 BL/6乳鼠心肌細胞的體外增殖特征。

3、　　方法:(1)采用混合酶消化法（0.08％胰蛋白酶和0.1％Ⅱ型膠原酶組成的混合酶消化液）消化不同日齡（出生1，3，5，7，9天）提取的新生C57 BL/6乳鼠心臟細胞，通過差速貼壁法和化學抑制劑法分離和純化心肌細胞，臺盼藍檢測細胞存活率。(2)分別對心肌細胞和成纖維細胞進行體外原代培養(yǎng)和上述二種細胞的共培養(yǎng)。(3)用倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長情況和形態(tài)變化;分別用α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actin，α-SA)

4、抗體和波形蛋白(Vimentin)抗體對心肌細胞和成纖維細胞進行免疫細胞化學染色，以鑒定細胞的純度。通過記錄心肌細胞每分鐘的搏動次數(shù)測定心肌細胞的細胞活力。(4) MTT法測定單獨培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下心肌細胞的增殖活性。(5)檢測各組細胞中細胞周期調(diào)控因子CyelinD1和CDK4、心臟分化相關(guān)因子GATA4、Nkx2.5以及成纖維細胞生長因子FGF1的表達情況。
　　結(jié)果:(1)混合消化酶提取的細胞數(shù)量多，存活率高;培養(yǎng)1h后成纖

5、維細胞先貼壁，12h后心肌細胞幾乎全部貼壁。(2)心肌細胞中α-橫紋肌動蛋白表達呈陽性，純度可達93％，成纖維細胞中波形蛋白表達呈陽性，純度可達95％。(3)共培養(yǎng)24 h后，心肌細胞多以細胞團的形式貼壁生長，可見部分細胞團的自發(fā)搏動;單獨培養(yǎng)24 h后，心肌細胞貼壁呈梭形;共培養(yǎng)的心肌細胞比單獨培養(yǎng)的心肌細胞交聯(lián)速度快，達到搏動同步的時間早。(4)出生5天以內(nèi)的乳鼠心肌細胞數(shù)量和體積明顯增大，共培養(yǎng)的心肌細胞的細胞活力更大、增殖速度快

6、;出生5天以后的乳鼠心肌細胞數(shù)量變化并不明顯。(5)出生5天以內(nèi)的乳鼠心肌細胞中CyclinD1和CDK4的表達量較高，且共培養(yǎng)的心肌細胞表達量要高于單獨培養(yǎng)的心肌細胞表達量;GATA4、Nkx2.5和FGF1的表達隨日齡增大而增加。
　　結(jié)論:(1)差速貼壁法和化學抑制劑法能夠有效地分離心肌細胞和成纖維細胞，得到純度高、活力好的心肌細胞。(2)不同日齡的心肌細胞在共培養(yǎng)環(huán)境下生長狀態(tài)良好。(3)出生5天內(nèi)的心肌細胞體外培養(yǎng)時具有

7、較強的增殖能力，且成纖維細胞能促進心肌細胞增殖;出生5天以后的乳鼠心肌細胞的增殖能力減弱甚至消失。(4)建立新生乳鼠心肌細胞和成纖維細胞體外原代培養(yǎng)和共培養(yǎng)方法可用于后續(xù)的研究觀察。
　　二、NLRP3炎癥小體激活后對心肌細胞體外增殖的影響研究
　　目的:研究成纖維細胞中的NLRP3炎癥小體激活后對新生C57BL/6乳鼠心肌細胞體外增殖能力的影響。
　　方法:(1)采用雙酶消化法分別提取日齡為1天的野生型和Nlrp3-

8、/-基因敲除C57BL/6小鼠乳鼠心臟細胞，通過差速貼壁法和化學抑制劑法分離和純化心肌細胞和成纖維細胞。(2)將細胞按如下分組接種到細胞培養(yǎng)板:野生型成纖維細胞單獨培養(yǎng)，野生型成纖維細胞與心肌細胞共培養(yǎng)，Nlrp3-/-成纖維細胞與野生型心肌細胞共培養(yǎng)，Nlrp3-/-心肌細胞單獨培養(yǎng)。各組細胞在體外正常培養(yǎng)24h后，分別加入10ng/mL的LPS，作用24 h，再加入3mM的ATP刺激1h，同時設立正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的對照組。(3)用倒置

9、相差顯微鏡觀察各實驗組細胞與對照組細胞的生長情況;MTT法測定細胞的增殖活性;收集培養(yǎng)板中各組細胞，用蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot方法檢測炎癥因子NLRP3、ASC、Caspase-1，細胞周期調(diào)控因子CDK4、Cyclin D1，心肌細胞增殖分化相關(guān)因子Nkx2.5、GATA4蛋白的表達情況;用real time PCR(熒光定量PCR)檢測相應基因的mRNA表達水平;ELISA方法檢測各組細胞培養(yǎng)液上清中的

10、IL-1β含量;對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:(1)與對照組相比，經(jīng)LPS/ATP刺激的實驗中，單獨培養(yǎng)的心肌細胞活性有所降低，數(shù)量略有減少。共培養(yǎng)的心肌細胞受到損傷且細胞數(shù)量明顯減少;野生型心肌細胞受損程度大于Nlrp3-/-心肌細胞。(2) Western Blot檢測結(jié)果顯示:與對照組相比，實驗組的NLRP3、ASC、Caspase-1表達顯著增加、CDK4、Cyclin D1、Nkx2.5、GATA4表達降低;real