鹽對(duì)CRF大鼠的心臟磷酸化蛋白質(zhì)組及OVLT內(nèi)RAS的影響.pdf

1、背景：慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)是一種亟待解決的全球性公共健康問(wèn)題，而心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是影響慢性腎臟病預(yù)后的主要因素。我國(guó)透析患者CVD的死亡率為47％，是導(dǎo)致慢性腎衰竭患者死亡的第一位原因。慢性腎衰的心血管并發(fā)癥主要包括左室肥厚(Left ventricular hypertrophy，LVH)和擴(kuò)張、心肌缺血和外周血管疾病。幾乎所有的終末期腎臟

2、病患者都合并有CVD，必須引起重視的是，CVD并非僅見(jiàn)于終末期腎臟病患者，事實(shí)上LVH在CKD早期就已經(jīng)普遍出現(xiàn)了，而進(jìn)展至ESRD時(shí)幾乎全部患者都存在LVH。LVH是確認(rèn)存在心血管終末器官損害的指標(biāo)之一。腎損傷是CKD患者出現(xiàn)臨床癥狀的直接原因，同時(shí)還能夠通過(guò)神經(jīng)體液調(diào)節(jié)路徑的持續(xù)激活引起左室收縮功能障礙、心臟灌注壓升高和心室擴(kuò)張等心血管并發(fā)癥。CKD中存在的刺激因素主要包括交感神經(jīng)系統(tǒng)的高反應(yīng)性、腎素血管緊張素系統(tǒng)的激活、一氧化氮和

3、活性氧簇的平衡紊亂和慢性炎癥狀態(tài)的維持，這些在CVD的發(fā)生發(fā)展中起到了非常重要的作用。另外，CVD也可以直接作用于腎臟，通過(guò)減少腎臟灌注和腎動(dòng)脈硬化來(lái)促進(jìn)慢性腎臟病的發(fā)生和發(fā)展。 CVD是慢性腎臟病患者病程進(jìn)展與死亡的主要原因，而高血壓是CKD患者中CVD發(fā)生的顯著性獨(dú)立危險(xiǎn)因素。美國(guó)國(guó)家腎臟基金會(huì)腎臟疾病預(yù)后質(zhì)量計(jì)劃提示，CKD患者普遍存在高血壓。無(wú)論是作為引起CKD的原因還是CKD的結(jié)果，高血壓都是決定腎功能水平的非常重要的獨(dú)立危險(xiǎn)

4、因素。來(lái)自人類(lèi)與動(dòng)物的流行病學(xué)、干預(yù)與遺傳病學(xué)的研究明確指出了血壓依賴于鹽攝入的關(guān)系。鹽敏感個(gè)體相對(duì)鹽抵抗個(gè)體更容易出現(xiàn)心血管系統(tǒng)的并發(fā)癥，且都獨(dú)立于傳統(tǒng)的心血管危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期高鹽攝入增加會(huì)引起明顯的血壓升高反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)加重高血壓引起的終末器官結(jié)構(gòu)和功能損害，并且這一損害并非單單由血壓升高引起?；谛呐K對(duì)高鹽攝入反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)高鹽能引起動(dòng)脈血壓升高，同時(shí)能夠引起血管纖維化、心室缺血和收縮功能障礙。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白的復(fù)雜性、用

5、途和生物特性的技術(shù)，是以蛋白的生物多樣性為基礎(chǔ)，包括蛋白亞型、翻譯后修飾（以磷酸化修飾為主）等。心臟蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為解開(kāi)心血管疾病中存在的信號(hào)通路的不可缺少的技術(shù)，很多重要的心血管功能如鈣平衡、心臟收縮和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都是通過(guò)蛋白的磷酸化與去磷酸化實(shí)現(xiàn)的。蛋白磷酸化信號(hào)途徑的紊亂與多種心血管疾病（如心臟肥厚、缺血再灌注損傷）相關(guān)，而且蛋白質(zhì)磷酸化信號(hào)分子還被作為心血管藥物的靶點(diǎn)。盡管心血管并發(fā)癥在慢性腎臟病中的重要性被廣泛認(rèn)識(shí)，但是相關(guān)

6、的分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)對(duì)慢性腎衰大鼠中心臟磷酸化蛋白進(jìn)行定性和定量研究以及觀察給予高鹽飲食后心臟蛋白的磷酸化水平的改變，從而為探索慢性腎臟病中并發(fā)的心血管疾病的機(jī)制提供線索。
　　 方法：⑴雄性Sprague Dawley大鼠（購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重150-180g，在SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)（南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），自由進(jìn)水和飲食。⑵大鼠體重200g左右行左側(cè)腎臟2/3切，一周后進(jìn)行

7、右側(cè)腎全切（完全保留雙側(cè)的腎上腺），假手術(shù)大鼠只進(jìn)行腎包膜剝離。造模期間，分別在術(shù)后4周、8周和10周通過(guò)眼眶靜脈采血，檢測(cè)大鼠血肌酐水平。⑶給予不同濃度鹽飼料刺激的最后三天，代謝籠內(nèi)單只單籠飼養(yǎng)，連續(xù)三天收集24h尿液，記錄總尿量后，留取4ml尿樣。并測(cè)量尾動(dòng)脈血壓。⑷以3％戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血后迅速打開(kāi)胸腔，16#灌胃針從左心室穿刺入主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，4℃預(yù)冷的生理鹽水（含肝素20U/ml

8、）200ml快速灌注。⑸200ml預(yù)冷生理鹽水灌注完畢后立即分離心臟，稱(chēng)重后去除心房和右心室，取左心室游離壁組織PBS反復(fù)清洗后包于錫箔紙中，液氮速凍，-80℃保存。⑹所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，所有統(tǒng)計(jì)分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。兩種樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);方差齊的多種樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用LSD法，方差不齊的多種樣本均數(shù)的比較采用Welch法，兩兩比較

9、采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑺每組取等量肽段(約80ug)，按照試劑盒:iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記，重復(fù)標(biāo)記1次。將標(biāo)記后的肽段溶液混合，取1/10體積的混合肽段脫鹽，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。取剩余的9/10體積混合肽段真空凍干，凍干后用于二氧化鈦富集。⑻標(biāo)記后的混合肽段溶液真空凍干，加入1×DHB buffer復(fù)溶。溶液中加入Ti0

10、2 beads，振蕩40min，離心，移去上清液。將beads轉(zhuǎn)入具塞tip頭中，加入Washing buffer1洗滌三次，加入Washing buffer2洗滌三次。加入Elution buffer洗脫，收集磷酸化肽段，真空濃縮，用20μL0.1％ FA溶解，取10μL用于質(zhì)譜分析。⑼樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan)進(jìn)行質(zhì)譜分析。⑽質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，用軟件Masc

11、ot2.2和ProteomeDiscoverer1.3(Thermo Scientific)進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。⑾查庫(kù)使用Mascot軟件版本為Mascot2.2。查庫(kù)時(shí)將RAW文件通過(guò)Proteome Discoverer提交至Mascot服務(wù)器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫(kù)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。⑿Proteome Discoverer1.3軟件根據(jù)肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析。肽段定量結(jié)果為參考樣品所在標(biāo)簽的信號(hào)強(qiáng)度值與其他標(biāo)簽的

12、信號(hào)強(qiáng)度值的比值。蛋白質(zhì)定量結(jié)果為鑒定肽段定量結(jié)果的中位數(shù)。最終定量結(jié)果再以各標(biāo)簽比值中位數(shù)進(jìn)行歸一化處理，以消除實(shí)驗(yàn)中人為因素引入的上樣量誤差。⒀質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Mascot軟件搜索后，再由Proteome Discoverer1.3軟件對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行分析(Phospho RS score，Phosphop RS sequence probability，PhosphoRS site probabilities), Phospho RS

13、score大于50分，Phospho RS site probabilities大于75％說(shuō)明磷酸化修飾的可信度較高。
　　 結(jié)果：⑴大鼠造模后第9周，測(cè)量血壓，稱(chēng)重并采集大鼠血液測(cè)定血肌酐水平，發(fā)現(xiàn)慢性腎衰大鼠與假手術(shù)組相比，血肌酐、動(dòng)脈血壓及24小時(shí)尿蛋白明顯升高，而體重?zé)o明顯改變（獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，體重，t=1.559，P=0.14;血肌酐，t=-4.021，P=0.01;動(dòng)脈血壓，t=-2.597，P=0.02;24小時(shí)尿

14、蛋白，t=-6.686，P=0.01）。⑵高鹽刺激14天后，與sham大鼠相比，CRF大鼠的心重、心重體重比、動(dòng)脈血壓、24小時(shí)尿蛋白明顯升高，高鹽加劇了這一改變，并且能夠增加CRF大鼠血鈉和24小時(shí)尿鈉排泄（One-Way ANOVA，心臟重量，F(xiàn)=25.96，P=0.001;心臟/體重比值，F(xiàn)=49.960，P=0.000;SBP，F(xiàn)=13.635，P=0.001;血鈉，F(xiàn)=7.683，P=0.004;24h尿鈉，F(xiàn)=8.901，P

15、=0.000;24h蛋白，F(xiàn)=64.782，P=0.000）。⑶共鑒定了1877種蛋白，對(duì)其中的1830種進(jìn)行了定量。正常鹽組中腎衰大鼠與假手術(shù)相比226種蛋白發(fā)生了差異性改變，其中107種升高，119種降低;慢性腎衰大鼠中高鹽組大鼠與正常鹽組相比220種發(fā)生了差異性改變，其中120種升高，100種降低。⑷本實(shí)驗(yàn)通過(guò)iTRAQ技術(shù)共鑒定了1884種磷酸化肽段，其中1724種進(jìn)行了定量。正常鹽組中腎衰大鼠與假手術(shù)大鼠相比165種磷酸化肽段

16、發(fā)生了差異性改變，其中89種升高，76種降低;慢性腎衰大鼠中高鹽組與正常鹽組相比172種磷酸化肽段發(fā)生了差異性改變，其中83種升高，89種降低。⑸采用DAVID6.7軟件對(duì)檢測(cè)到的763種磷酸化蛋白進(jìn)行GO分類(lèi)檢索。這些磷酸化蛋白主要具有結(jié)合、催化活性、酶調(diào)節(jié)活性轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等功能，涉及代謝、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)刺激的反應(yīng)、細(xì)胞生物合成、細(xì)胞通訊、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等生物進(jìn)程。⑹采用Proteome Discov

17、erer1.3(Thermo Scientific)軟件對(duì)鑒定到的1724種磷酸化肽段進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，1002種肽段只有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)被磷酸化，2個(gè)磷酸化位點(diǎn)被磷酸化的共有628種，3個(gè)磷酸化位點(diǎn)被磷酸化的共有83種，4個(gè)被磷酸化的共有11種，其中以1個(gè)被磷酸化的占的比例最大，為58.1％，其余各占36.4％、4.8％、0.6％。再對(duì)1個(gè)磷酸化位點(diǎn)被磷酸化的磷酸化肽段(1002種)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)類(lèi)型(S/T/Y)分析，以Phosph

18、o RS site probabilities大于75％為入選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示以pSer最為常見(jiàn)，為56.4％，pThr其次，占5.2％，pThy最少，占1.4％。⑺采用String軟件對(duì)本次實(shí)驗(yàn)NC/NS組和HC/NC組檢測(cè)到的140和138種差異磷酸化蛋白進(jìn)行蛋白相互作用分析，發(fā)現(xiàn)NC/NS組中15種磷酸化蛋白(Des、Vcl、Gja1、Tnni3、Mybpc3、Myh6、Lmna、Myoz3、Tns1、Pxn、Ctnna1、Pkp2

19、、Dsp、Map1b、Dynclli1)能夠形成網(wǎng)絡(luò)，連接最多的2個(gè)蛋白分別是des和vcl，是慢性腎衰大鼠中心臟的磷酸化蛋白信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)。HC/NC組中23種磷酸化蛋白(Des、Vcl、Gja1、Tnni3、Mybpc3、Myh6、Myh7、Myh11、Myh9、Ryr2、Jph2、Lmna、Vim、Myoz3、Srrm1、Smm2、Hnrpd、Map1a、Map1b、Khdrbs2、Hsd17b8、Eif4b、Eif3s9

20、)能夠形成網(wǎng)絡(luò)，連接最多的3個(gè)蛋白分別是Des、Myh7和Tnni3，是給予高鹽飲食后慢性腎衰大鼠的心臟的磷酸化蛋白信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)。⑻通過(guò)David在線分析軟件，我們對(duì)NC/NS組與HC/NC組檢測(cè)到的140和138種磷酸化蛋白所涉及到的KEGG信號(hào)通路進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)NC/NS組中34種磷酸化蛋白(Atp2b1、Lmo7、Atp1a3、Slk、Ablim1、Adcy6、Camkk2、Ctnna1、Des、Dsg2、Dsp、Ep

21、b4111、Flnc、Pkp2、Pln、Pgk1、Pxn、Myh9、Myh9、Mybpc3、Mapk14、Lmna、Rply2、Gys1、Gja1、Vcl、Tnni3、Smap2、Rp12212、Ndufv3-ps1、Srf、Pdha1、Ppp1r3d、Tjp1）涉及到鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、心臟肌肉收縮、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、醛固酮相關(guān)的鈉的重吸收、胰島素信號(hào)通路、MAPK、糖酵解/糖異生

22、、VEGF和縫隙連接等信號(hào)通路，其功能涉及代謝、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)等過(guò)程。HC/NC組中34個(gè)蛋白質(zhì)（Cr11、Blvrb、Ablim1、Ablim3、Rab4a、Pgls、Agpat2、Olr1475、Myh9、Myh7、Myh6、Mybpc3、Mapk14、Lmna、Herc1、Hspb1、Tjp1、Slc2a4、Hsp90ab1、Eif4b、LOC100362857、Pdha1、Pcca、Pcyt1a、LOC312502、Atp2b1

23、、Lmo7、Des、Dsp、Pln、Gys1、Gja1、Vcl、Tnni3)涉及到鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、心臟肌肉收縮、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、醛固酮相關(guān)的鈉的重吸收、胰島素信號(hào)通路、MAPK、糖酵解/糖異生、Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、RIG-Ⅰ樣受體信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路和縫隙連接等信號(hào)通路，其功能涉及代謝、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)等過(guò)程。
　　 結(jié)論：①運(yùn)用iTRAQ

24、技術(shù)成功研究了慢性腎衰大鼠的心臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，構(gòu)建了慢性腎衰大鼠的心臟磷酸化蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)了與慢性腎衰并發(fā)的心臟損害相關(guān)的140種差異磷酸化蛋白，構(gòu)建了15個(gè)磷酸化蛋白參與的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)采用KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)34個(gè)蛋白參與了肥厚型心肌病、鈣信號(hào)傳導(dǎo)等通路。②高鹽使慢性腎衰大鼠的心臟中138種磷酸化蛋白的磷酸化水平發(fā)生了改變，其中23個(gè)差異磷酸化蛋白能夠形成網(wǎng)絡(luò)，34種蛋白涉及到鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和肥厚型心肌病等信號(hào)通路，其功能涉