微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細胞氧化損傷及機制探討.pdf

1、目的：
　　 體外培養(yǎng)原代大鼠卵巢顆粒細胞，觀察微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細胞氧化損傷對卵巢顆粒細胞增殖、激素分泌、DNA損傷、凋亡及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的影響，并探討微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細胞氧化損傷及其作用機制。
　　 方法：
　　 1.無菌條件下分離提取21-25日齡雌性Wistar大鼠卵巢顆粒細胞，繪制細胞生長曲線。取對數(shù)生長期細胞，以0、10、20、30μg/mlMC-LR染毒卵巢顆粒

2、細胞，MTT法分別檢測染毒24h、48h、72h的細胞增殖情況，建立大鼠原代卵巢顆粒細胞MC-LR染毒模型。
　　 2.以0、10、20、30μg/mlMC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細胞48h，熒光法測定細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、比色法測定細胞培養(yǎng)液中超氧化物岐化酶（T-SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。
　　 3.染毒條件同前，MTT法檢測大鼠卵巢顆粒細胞增殖情況，電化學(xué)發(fā)光法測定細胞培養(yǎng)液中雌二醇（E2）和孕酮（P）

3、含量。
　　 4.染毒條件同前，單細胞凝膠電泳檢測大鼠卵巢顆粒細胞DNA損傷情況。
　　 5.染毒條件同前，TUNEL細胞凋亡檢測法檢測大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況。
　　 6.染毒條件同前，實時熒光定量PCR測定大鼠卵巢顆粒細胞Bax和Bcl-2基因mRNA的表達量變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細胞48h，細胞增殖受到明顯抑制（P﹤0.05），

4、Spearman分析提示MC-LR染毒劑量與細胞增殖呈顯著負相關(guān)（rs值=-0.767，P=0.000），有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，因此選定48h作為MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細胞的最優(yōu)作用時間，建立大鼠原代卵巢顆粒細胞MC-LR染毒模型。
　　 2.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細胞48h，細胞培養(yǎng)液中MDA含量隨著染毒劑量增加而增高，細胞內(nèi)ROS含量也隨著升高，同時細胞培養(yǎng)液中T-SOD活性隨之下降；與對

5、照組比較，20μg/ml、30μg/ml染毒組細胞培養(yǎng)液中MDA含量和細胞內(nèi)ROS含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）；與對照組比較，各劑量組細胞培養(yǎng)液中T-SOD活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　 3.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細胞48h，20μg/ml和30μg/ml劑量組細胞培養(yǎng)液中雌二醇（E2）、孕酮（P）含量顯著降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。
　　

6、4.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細胞48h，出現(xiàn)拖尾細胞數(shù)隨劑量增加而增加，提示細胞DNA損傷逐步加重。
　　 5.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細胞48h，隨著染毒劑量升高卵巢顆粒細胞凋亡率升高。與對照組比較，20μg/ml和30μg/ml劑量組細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細胞48h，細胞Bax基因表達上

7、調(diào)， Bcl-2基因表達下調(diào)，與對照組比較，20μg/ml和30μg/ml劑量組Bax、Bcl-2基因表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外實驗條件下，MC-LR可引起卵巢顆粒細胞氧化應(yīng)激損傷，使細胞內(nèi)ROS水平升高，細胞培養(yǎng)液中T-SOD活性下降，MDA含量上升，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.體外實驗條件下，MC-LR具有卵巢顆粒細胞毒性，可明顯抑制大鼠卵巢顆粒細胞的增殖，