CD36在糖尿病腎臟的表達(dá)及抗氧化肽SS-31對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：在發(fā)展中國家，糖尿病是導(dǎo)致慢性腎衰的主要原因之一，在全球范圍內(nèi)擁有很高的發(fā)病率和死亡率。在糖尿病引起的微血管并發(fā)癥中，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）是糖尿病引起終末期慢性腎功能衰竭（Chronic Renal Failure, CRF）加重患者死亡的重要原因。許多機(jī)制參與糖尿病腎病的疾病過程，包括代謝和血流動力學(xué)改變，炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，腎素血管緊張素系統(tǒng)的激活等。其中高糖環(huán)境誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激在

2、糖尿病腎病的進(jìn)展中起到的作用得到越來越多的認(rèn)可。
　　大量研究顯示，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成增多是糖尿病高血糖環(huán)境誘導(dǎo)腎臟形態(tài)學(xué)及功能損傷的原始動力。在糖尿病腎病腎小管細(xì)胞，高糖環(huán)境能夠促進(jìn)晚期糖基終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs)生成增加，腎素血管緊張素系統(tǒng)(angiotensin II，Ang II)及蛋白激酶C(Protein

3、kinase, PKC)信號通路的激活等,均可導(dǎo)致ROS生成增加，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時，越來越多的研究認(rèn)為，糖尿病高血糖、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種因素均能激活炎癥相關(guān)信號通路，包括細(xì)胞粘附分子、生長因子的生成增加、腎臟間質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤、前炎癥因子的釋放。糖尿病腎臟的炎癥反應(yīng)一方面激活JNK、NF-kB及P38MAPK等信號通路，另一方面誘導(dǎo)ROS的生成增多。炎癥與氧化應(yīng)激相互作用，加重腎間質(zhì)纖維化（Renal Interstitial F

4、ibrosis，RIF），促進(jìn)腎損害的發(fā)生。然而糖尿病腎病腎組織的炎癥及氧化應(yīng)激的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。
　　CD36屬于B組清道夫受體家族，最早被命名為血小板膜糖蛋白IV，是一種細(xì)胞表面單鏈跨膜糖蛋白。CD36在巨噬細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板及上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表面表達(dá)，參與機(jī)體的多種生物學(xué)過程，具有多種功能。有研究顯示，在慢性腎臟疾病、缺血性腦卒中、動脈粥樣硬化及代謝紊亂等多種疾病狀態(tài)下，CD36均能夠參與調(diào)解炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)

5、機(jī)體氧化應(yīng)激。新近的研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白及AGEs均能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)CD36，敲除CD36表達(dá)能夠明顯減少白蛋白及AGEs誘導(dǎo)的腎組織炎癥及纖維化改變。在高脂飲食喂養(yǎng)的單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠模型體內(nèi)，下調(diào) CD36表達(dá)能夠通過抑制 NF-kB等前炎癥信號通路，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)及ROS生成。而在對糖尿病腎病的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，高糖能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá) CD36，增加的 CD36能夠通過激活 p38MAPK等信號通路參與高糖誘導(dǎo)的腎小

6、管上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Yang等則發(fā)現(xiàn)， CD36能夠通過活化 TGF-β1/CTGF等相關(guān)信號通路參與糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生。綜上可見，CD36與炎癥、氧化應(yīng)激及纖維化改變密切相關(guān)，而炎癥及氧化應(yīng)激又是糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制之一，由此我們推斷CD36很可能參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。
　　SS-31(D-Arg-2’,6’-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)是一種線粒體定位，具有抗氧化作用的小分子肽。

7、通過清除線粒體內(nèi)過度生成的ROS及抑制線粒體ROS生成，發(fā)揮抗氧化作用。有研究證明，在胰島細(xì)胞，SS-31能夠抑制線粒體膜電位下降，增加胰島細(xì)胞存活率，抑制胰島細(xì)胞凋亡。在高糖刺激的人視網(wǎng)膜細(xì)胞中，SS-31同樣能夠抑制線粒體 ROS生成，穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位。在對缺血再灌注腦損傷及單側(cè)輸尿管結(jié)扎動物模型中研究者發(fā)現(xiàn)，SS-31與機(jī)體氧化應(yīng)激關(guān)系密切。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病，SS-31能夠抑制線粒體ROS生成，保護(hù)線粒體功能

8、，減少腎臟細(xì)胞凋亡等，從而起到保護(hù)腎臟的作用。而新近的研究認(rèn)為，缺血性腦卒中小鼠體內(nèi)，SS-31的抗氧化應(yīng)激作用是通過一個CD36依賴的途徑實現(xiàn)的。提示SS-31的抗氧化作用機(jī)制可能與CD36相關(guān)。
　　因此，在本課題中，我們首先檢測了CD36在糖尿病腎臟中的表達(dá)情況，進(jìn)一步應(yīng)用基因敲除技術(shù)敲低CD36表達(dá)，觀察糖尿病腎小管上皮細(xì)胞在炎癥、氧化應(yīng)激及纖維化等方面改變，從而探討CD36在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。除此之外，我

9、們研究了抗氧化肽SS-31與CD36的關(guān)系，為糖尿病腎病治療提供新靶點。
　　方法：
　　1糖尿病腎病臨床患者、db/db小鼠腎臟組織及高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中CD36蛋白檢測
　　臨床患者腎臟標(biāo)本包括2型糖尿病腎病組（DM group）10例及對照組（control group）10例。其中10例2型糖尿病腎病患者均為經(jīng)病史、臨床檢查及腎穿刺活檢病理確診為糖尿病腎病患者。10例對照組來自腎臟腫瘤患者遠(yuǎn)離腫瘤的瘤旁組織

10、(>5cm)。各組腎臟組織常規(guī)石蠟包埋、切片。采用H.E染色、PAS染色及Masson染色技術(shù)檢測各組腎臟病理改變情況。采用免疫組織化學(xué)方法檢測各組CD36蛋白表達(dá)；
　　動物標(biāo)本收集：8周齡、SPF級、健康、雄性 C57BL/ks db/db小鼠（40±2.5g）8只及雄性C57BL/ks db/m對照小鼠（20±2.5g）8只，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。于溫度22±2°C，相對濕度55±2％環(huán)境下常規(guī)喂養(yǎng)，于小鼠20周齡

11、時處死取材，留取尿液及血清；取部分腎組織置于4%多聚甲醛固定，用于光鏡觀察；部分腎皮質(zhì)組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80°C冰箱，用于提取總蛋白及總RNA進(jìn)行Western blot和Real-time PCR檢測。
　　細(xì)胞標(biāo)本收集：條件永生性人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC，American Type Culture Collection）。于5%CO2，37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將實驗HK-2細(xì)胞

12、分成2組：正常糖對照組0h（5.5 mmol/L glucose, NG）、高糖組（30 mmol/L glucose，HG）。將各組細(xì)胞同步化，高糖組于干預(yù)后6h、12h、24h、48h、72 h收集細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞總蛋白及總RNA進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。
　　2敲低CD36對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激及轉(zhuǎn)分化的影響
　　制備CD36siRNA，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞

13、。將實驗HK-2細(xì)胞分成5組：正常糖對照組（5.5 mmol/L glucose, NG）、正常糖+高滲對照組（5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol, M）、高糖組（30 mmol/L glucose，HG）、高糖+CD36siRNA轉(zhuǎn)染組（30 mmol/L glucose+CD36siRNA， siRNA）、高糖+SSO組（30 mmol/L glucose+0.5mM SSO， SSO）。

14、分別經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)刺激48小時后收集細(xì)胞；Western blot檢測CD36、NF-kB、Histone3、p-iκB、Total iκB、ERK1/2、p-ERK1/2、Collagen I、Fibronectin、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、CTGF， Smad2、p-Smad2蛋白表達(dá)；Real-time PCR檢測CD36、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1及CTGF mRNA表達(dá)；EL

15、ISA檢測細(xì)胞上清中IL-1β、MCP-1、TNF-α、Collagen I、 Fibronectin分泌。細(xì)胞免疫熒光染色檢測 CD36、NF-kB、α-SMA及E-cadherin的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測ROS。
　　為檢測CD36與氧化應(yīng)激關(guān)系，加用細(xì)胞及線粒體ROS抑制劑NAC及Tempol，將實驗細(xì)胞分為6組：正常糖對照組（5.5 mmol/L glucose, NG）、正常糖+高滲對照組（5.5 mmol/L gluco

16、se+24.5 mmol/L mannitol, M）、高糖組（30 mmol/L glucose，HG）、高糖+NAC組（30 mmol/L glucose+5 mmol/L N-Acety-L–Gysteine， NAC）、高糖+Tempol組（30 mmol/L glucose+2 mmol/L Tempol，Tempol）、高糖+NAC+Tempol組（30 mmol/L glucose+5 mmol/L N-Acety-L-G

17、ysteine+2 mmol/L Tempol，NT）分別經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)刺激48小時后收集細(xì)胞，應(yīng)用Western blot及Real-time PCR檢測CD36蛋白及mRNA表達(dá)。
　　3抗氧化肽SS-31對db/db小鼠腎臟及高糖刺激的HK-2細(xì)胞CD36表達(dá)的影響
　　動物實驗：6~8周齡雄性db/db小鼠隨機(jī)分為：db/db糖尿病組（db/db）、db/db糖尿病+SS-31藥物干預(yù)組（db/db+SS-3

18、1）。同周齡雄性db/m小鼠作為正常對照組（db/m）及db/m+SS-31藥物干預(yù)對照組（db/m+SS-31）。db/db+SS-31和db/m+SS-31組以SS-31（3 mg/kg）腹腔注射，每天一次持續(xù)12周。每2周檢測一次血糖水平。于動物20周齡時處死動物取材，同時記錄腎重、體重。留取血和尿標(biāo)本檢測血糖（Glu）、24小時尿蛋白定量（UPE）、肌酐（Scr）。采用PAS染色技術(shù)檢測各組腎臟病理改變情況。ELISA法檢測尿中

19、 MDA及8-OHdG含量。Western blot法檢測MnSOD、CAT、NOX4、p22、CD36、NF-κB蛋白表達(dá)，Real-time PCR檢測 MnSOD、CAT、NOX4、p22、CD36mRNA表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色檢測CD36表達(dá)。
　　細(xì)胞實驗：將實驗HK-2細(xì)胞分成4組：正常糖對照組（5.5 mmol/L glucose, NG）、正常糖+高滲對照組（5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol

20、/L mannitol, M）、高糖組（30 mmol/L glucose，HG）、高糖+SS-31藥物干預(yù)組（30 mmol/L glucose+100nM SS-31，SS-31）。分別經(jīng)細(xì)胞同步化、于刺激48 h后收集細(xì)胞。Western blot檢測MnSOD、CAT、NOX4、p22、CD36、NF-κB蛋白表達(dá)，Real-time PCR檢測 MnSOD、CAT、NOX4、p22、CD36mRNA表達(dá)。免疫細(xì)胞熒光染色檢測各

21、組NF-κB及CD36的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測線粒體ROS水平。
　　結(jié)果：
　　1 CD36在糖尿病腎組織表達(dá)情況
　?、賹φ战M腎組織未見明顯異常；DN組腎小球體積增大，基底膜彌漫或不規(guī)則增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，間質(zhì)纖維化。②對照組腎組織未見明顯CD36表達(dá)，與對照組相比，DN組CD36表達(dá)明顯增加（P<0.05），且CD36主要在近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，遠(yuǎn)端腎小管表達(dá)較少，腎小球及腎間質(zhì)

22、未見明顯表達(dá)。③db/db組小鼠空腹血糖及腎重/體重增加明顯。與db/m組相比，db/db組小鼠血肌酐及24小時尿蛋白量較db/m組均明顯增多（P<0.05）。④與db/m組相比， db/db組小鼠腎臟CD36蛋白表達(dá)及mRNA水平明顯增加（P<0.05）。CD36表達(dá)主要分布在近端腎小管上皮細(xì)胞，遠(yuǎn)端腎小管表達(dá)較少，腎小球及腎間質(zhì)未見明顯表達(dá)。⑤CD36蛋白表達(dá)及mRNA水平于高糖刺激HK-2細(xì)胞6h表達(dá)增加，于48h達(dá)高峰，呈現(xiàn)時間

23、依賴性，于72h有所下降（P<0.05）。CD36于細(xì)胞膜表達(dá)最多，胞漿線粒體可見部分表達(dá)。
　　2敲低CD36對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激的影響
　　①與NG組相比，HG組HK-2細(xì)胞上清中炎癥因子IL-1β、MCP-1、TNF-α分泌明顯增加（P<0.05）。而CD36siRNA敲除及CD36抑制劑SSO干預(yù)均能夠明顯抑制高糖誘導(dǎo)的 HK-2細(xì)胞炎癥因子 IL-β1、MCP-1、TNF-α的分泌(P<0.05）

24、。②與 NG組相比，HG組炎癥相關(guān)信號通路NF-kB、iκB及ERK1/2活化明顯增加（P<0.05）。CD36siRNA敲除及CD36抑制劑SSO干預(yù)均能抑制NF-kB、iκB及ERK1/2活化（P<0.05）。③與NG組相比，HG組HK-2細(xì)胞線粒體ROS生成明顯增加（P<0.05）。而與HG組相比，CD36siRNA敲除及CD36抑制劑SSO干預(yù)均能抑制高糖誘導(dǎo)的ROS生成增多（P<0.05）。④與NG組相比，HG組HK-2細(xì)胞C

25、D36蛋白表達(dá)及mRNA水平明顯增加（P<0.05）。與HG組相比。NAC干預(yù)、Tempol干預(yù)及 NAC+Tempol能抑制高糖上調(diào)的 CD36表達(dá)（P<0.05）。
　　3敲低CD36對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響
　?、貼G組與M組HK-2細(xì)胞上皮細(xì)胞邊界清晰，呈鵝卵石樣貼壁生長。HG組與載體對照組HK-2細(xì)胞邊界不清，胞體狹長；CD36siRNA敲除及應(yīng)用CD36抑制劑SSO組細(xì)胞較HG組細(xì)胞形態(tài)有所改善。②與

26、NG組相比，HG組 HK-2細(xì)胞表達(dá)及分泌 Collagen I及 Fibronectin明顯增加（P<0.05）。與HG組相比，CD36siRNA敲除及CD36抑制劑SSO干預(yù)均能抑制高糖誘導(dǎo)的 HK-2細(xì)胞表達(dá)及分泌 Collagen I及 Fibronectin(P<0.05）。③與NG組相比，HG組E-cadherin蛋白表達(dá)及mRNA水平明顯減少而α-SMA蛋白表達(dá)及 mRNA水平顯著增加（P<0.05）。敲低CD36和應(yīng)用C

27、D36抑制劑SSO干預(yù)能夠顯著抑制HG下調(diào)的E-cadherin表達(dá)，減少高糖誘導(dǎo)的α-SMA高表達(dá)（P<0.05）。④與NG組相比，HG糖組TGF-β1及CTGF蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著增加（P<0.05）。敲低CD36和應(yīng)用CD36抑制劑SSO干預(yù)能夠顯著抑制HG誘導(dǎo)的TGF-β1及CTGF過表達(dá)（P<0.05）。⑤與NG組相比，高糖組HK-2細(xì)胞Smad2磷酸化水平顯著升高（P<0.05）。CD36敲低組與應(yīng)用CD36抑制劑SS

28、O干預(yù)組細(xì)胞Smad2磷酸化水平明顯低于高糖組（P<0.05）。
　　4抗氧化肽SS-31對db/db小鼠腎臟及高糖刺激的HK-2細(xì)胞CD36表達(dá)的影響
　?、賒b/db糖尿病腎病組小鼠腎小球體積輕微增大，基底膜不規(guī)則增厚，系膜基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。db/db糖尿病腎病組小鼠腎重/體重、尿蛋白（Upro）、空腹血糖（FBG）、肌酐（Scr）比db/m對照組小鼠增加（P<0.05）。給予抗氧化肽SS-31治

29、療后FBG未見明顯改變。腎重/體重、Scr、Upro與db/db組比較明顯降低（P<0.05）。②與db/m對照組相比，db/db糖尿病腎病組小鼠尿中MDA及8-OHdG含量明顯增加，抗氧化肽SS-31干預(yù)能夠明顯減少小鼠尿MDA及8-OHdG含量。③與db/m對照組相比，db/db糖尿病腎病組小鼠腎組織MnSOD及CAT蛋白表達(dá)及mRNA水平明顯抑制，NOX4、p22及CD36蛋白表達(dá)和mRNA水平上升，NF-κB活化增加?？寡趸腟

30、S-31藥物干預(yù)能夠上調(diào)糖尿病狀態(tài)下抑制的MnSOD及CAT蛋白表達(dá)及mRNA水平，抑制糖尿病腎臟高表達(dá)的NOX4、p22、CD36蛋白表達(dá)和mRNA水平及NF-κB活化。④與NG組相比，HG組ROS生成增多。與HG組相比，SS-31藥物干預(yù)能夠抑制ROS生成（P<0.05）。⑤與NG組相比，HG組MnSOD及CAT蛋白表達(dá)及mRNA水平明顯降低，NOX4、p22、CD36表達(dá)及NF-κB活化增加。抗氧化肽SS-31藥物干預(yù)能夠上調(diào)高糖

31、抑制的MnSOD及CAT蛋白表達(dá)及mRNA水平，抑制高糖誘導(dǎo)的NOX4、p22、CD36過表達(dá)及NF-κB活化(P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1在2型糖尿病腎病臨床患者腎小管上皮細(xì)胞、2型糖尿病db/db小鼠腎小管上皮細(xì)胞及高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中CD36表達(dá)增加，且與糖尿病腎臟腎功能水平相關(guān)。提示CD36可能參與腎小管上皮細(xì)胞損傷過程。
　　2敲低CD36及CD36抑制劑SSO干預(yù)能夠減少高糖條件下HK-2細(xì)胞炎

32、癥因子分泌，同時抑制炎癥相關(guān)信號通路的活化。提示，CD36過表達(dá)與高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞炎癥狀態(tài)相關(guān)。
　　3敲低CD36及CD36抑制劑SSO干預(yù)能夠減少高糖條件下HK-2細(xì)胞ROS生成，抗氧化劑NAC和（或）Tempol預(yù)均能下調(diào)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞CD36過表達(dá)。提示，在腎小管上皮細(xì)胞，高糖可能通過ROS途徑上調(diào)CD36表達(dá)，CD36過表達(dá)進(jìn)一步加重高糖誘導(dǎo)的ROS生成。
　　4敲低CD36及CD36抑制劑SSO干預(yù)

33、能夠減少高糖條件下HK-2細(xì)胞Collagen I、 Fibronectin的表達(dá)及分泌，同時抑制HK-2細(xì)胞EMT。減少EMT相關(guān)信號通路TGF-β1/CTGF及Smad2信號通路的活化。提示， CD36過表達(dá)與高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT相關(guān)。
　　5抗氧化肽SS-31能夠減少糖尿病腎病小鼠腎臟肥大，改善血尿生化指標(biāo)水平。SS-31抑制糖尿病腎病小鼠及高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激水平、NADPH氧化酶的激活、CD36過表達(dá)及