糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1的表達(dá)及富氫液對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但大量研究表明，糖尿病持續(xù)的高糖狀態(tài)誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量活性氧（Reactive oxygen species, ROS）可直接攻擊體內(nèi)大分子物質(zhì)，產(chǎn)生過氧化變性、交聯(lián)或斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而促使糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)機(jī)體應(yīng)對ROS損傷時，某些保護(hù)性基因上游調(diào)節(jié)區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件(Anti-oxidative response element,

2、 ARE)會調(diào)控表達(dá)一系列保護(hù)性蛋白，以緩解細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，ARE可被細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子Nrf2激活。Nrf2/ARE通路是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的主要內(nèi)源性通路。因此，Nrf2的激活及下游抗氧化蛋白的表達(dá)可能為糖尿病腎病的防治提供新的靶點(diǎn)。本研究擬建立糖尿病大鼠模型，并給予富氫液進(jìn)行干預(yù)，測定腎組織中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、谷胱甘肽（glutathione hormone,GSH

3、）水平及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性反應(yīng)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激程度；應(yīng)用免疫組織化學(xué)、Western blot方法檢測腎組織中Nrf2、HO-1的表達(dá)情況。探討富氫液是否能通過激活Nrf2/ARE通路改善腎組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，以期為糖尿病腎病的防治提供新的理論依據(jù)。
　　方法：選擇SPF級健康雄性大鼠36只，體重約200±20g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空腹12小時，隨機(jī)選取12只，作為正常組

4、（NC組），其余24只建立糖尿病大鼠模型，分別給予STZ（65mg/Kg）腹腔注射,72小時后尾尖取血測血糖，血糖≥16.7mmol/L即為造模成功。NC組給予等量的檸檬酸緩沖液腹腔注射。糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM組)、富氫液干預(yù)組(HRS組)。HRS組給予12ml/kg HRS灌胃，NC組、DM組每天給予等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。分別于造模成功8周末、12周末，每組任取6只大鼠

5、，留取血、尿標(biāo)本，檢測血肌酐、血尿素氮及24小時尿蛋白；并取腎組織，制作病理切片，進(jìn)行蘇木素伊紅（HE）染色及糖原染色（PAS），觀察腎組織病理變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及Western blot方法檢測Nrf2、HO-1的表達(dá)情況。取部分腎皮質(zhì)制備勻漿液，測定MDA、GSH水平及SOD活性。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x±S)表示，應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性或方差齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn)

6、，以p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠一般情況
　　NC組大鼠精神狀態(tài)良好，體重增加，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)有光澤，尿量無明顯改變。DM組及HRS組自造模成功后，逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿等糖尿病癥狀，后期精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)晦暗且逐漸消瘦。其中DM癥狀明顯重于HRS組。
　　2.生化指標(biāo)
　　8周末和12周末，DM組和HRS組24小時尿蛋白、血糖、血肌酐、血尿素氮水平較NC組升高（P＜0.05

7、）；HRS組與DM組相比明顯降低（P＜0.05）。
　　3.氧化應(yīng)激指標(biāo)
　　DM組大鼠腎組織內(nèi)MDA含量與NC組相比明顯升高，給予富氫液干預(yù)后，MDA水平降低（P＜0.05）；DM組大鼠腎組織內(nèi)SOD活性、GSH水平與NC相比明顯降低，給予富氫液干預(yù)后，SOD活性、GSH水平升高（P＜0.05）。
　　4.腎臟形態(tài)學(xué)改變
　　光鏡顯示，NC組大鼠的腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯的病理學(xué)改變；DM組部分腎小球體積增大

8、，腎小球系膜基質(zhì)彌漫增多，系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚，部分部位出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。12周末上述病理改變最明顯，給予富氫液治療后，腎臟病變有所減輕。
　　5.Nrf2、HO-1的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：Nrf2、HO-1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中,表達(dá)強(qiáng)度為：HRS組＞DM組＞NC組（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示：Nrf2、HO-1的表達(dá)趨勢與免疫組織化學(xué)結(jié)

9、果一致。
　　結(jié)論：
　　1.糖尿病狀態(tài)下，大鼠腎組織GSH水平、SOD活性降低，MDA含量升高，Nrf2、HO-1表達(dá)增強(qiáng)，說明存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且Nrf2/ARE通路被激活。
　　2.富氫液可降低糖尿病大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮及尿蛋白水平，并降低腎組織MDA含量，提高GSH水平、SOD活性，上調(diào)Nrf2、HO-1的表達(dá)，表明富氫液對腎臟具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活Nrf2/ARE通路，減輕氧化應(yīng)激損