曲古抑素A對人胎兒成纖維細胞OCT4啟動子甲基化狀態(tài)及人類體細胞核移植胚胎發(fā)育影響.pdf

1、目的：研究曲古抑素A(TSA)人胎兒成纖維細胞(hEFs)OCT4啟動子DNA甲基化和人類體細胞核移植(hSCNT)胚胎發(fā)育的影響 方法：hEFs(3×105cells/90-mm dish)在貼壁培養(yǎng)48小時后更換新鮮hEFs培養(yǎng)基，并添加終濃度為50，100，200，300，400，500，600，700和800nM的TSA分別作用24，48和72小時，未加TSA處理的hEFs作為陰性對照。 (1)采用細胞流式法檢測

2、細胞凋亡，評價TSA對hEFs的毒性作用與濃度和時間的關(guān)系； (2)應(yīng)用免疫組化法及RT-PCR分析TSA對多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4表達的影響； (3)應(yīng)用免疫組化法檢測乙?；M蛋白H3水平，評價TSA對組蛋白乙?；降挠绊?； (4)應(yīng)用RT-PCR檢測DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)mRNA的表達水平分析TSA在DNA甲基化方面的作用； (5)通過重亞硫酸鹽PCR測序法(BSP)檢測了OCT4基因啟動

3、子甲基化狀態(tài)用于評價TSA對hEFsOCT4基因啟動子甲基化狀態(tài)影響； (6)利用50nM的TSA處理hSCNT，觀察TSA對克隆胚發(fā)育的影響。 結(jié)果： (1)TSA對hEFs細胞的毒性作用呈現(xiàn)濃度依賴性，隨濃度增加細胞存活率降低；三個作用時間比較，TSA對hEFs的毒性作用無統(tǒng)計學(xué)差異； (2)免疫組化結(jié)果顯示，TSA處理組細胞oct4蛋白的表達陰性； (3)RT-PCR結(jié)果表明，TSA處理組細

4、胞OCT4 mRNA陰性，與oct4蛋白免疫組化結(jié)果一致； (4)TSA能夠明顯提高組蛋白乙?；剑?(5)TSA對DNMT1 mRNA的表達具有抑制作用，隨TSA濃度增加抑制作用增強； (6)BSP結(jié)果顯示，100nM TSA處理細胞48小時OCT4啟動子DNA甲基化水平與非處理組相似，而與hES相比仍處于高度甲基化狀態(tài)； (7)hSCNT重構(gòu)胚激活后，用50nM TSA處理4小時，≥8細胞克隆胚胎形