系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞表型的Logistic回歸分析及Smad7基因啟動子甲基化狀態(tài)的相關(guān)研究.pdf

1、第一章系統(tǒng)性硬皮病患者皮損成纖維細(xì)胞系的建立、鑒定及生長特性研究 目的：建立原代培養(yǎng)系統(tǒng)性硬皮病患者皮膚成纖維細(xì)胞的穩(wěn)定方法，對體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并初步研究成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)的生長特性，為后階段實(shí)驗(yàn)建立堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 方法：采用組織塊法原代培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞；倒置光學(xué)顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞生長形態(tài)，同時結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)方法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定；采用MTT法測定體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長曲線。 結(jié)果：皮膚成纖維細(xì)胞

2、約1周左右從組織塊周圍爬出，約3周左右時間可成功傳代；培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞排列極性明顯，呈放射狀或漩渦狀，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，培養(yǎng)細(xì)胞鑒定為成纖維細(xì)胞；MTT法測皮膚成纖維細(xì)胞生長曲線顯示，細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)“S”型，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，適合下一步實(shí)驗(yàn)。 結(jié)論：體外成功培養(yǎng)系統(tǒng)性硬皮病皮膚成纖維細(xì)胞，符合成纖維細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)，成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)良好，為我們進(jìn)行下階段實(shí)驗(yàn)保證了充足實(shí)驗(yàn)材料。 第二章

3、系統(tǒng)性硬皮病患者皮損成纖維細(xì)胞表型的Logistic回歸分析 背景與目的：系統(tǒng)性硬皮病患者皮損成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時可展現(xiàn)出膠原蛋白分泌過高的硬皮病表型，具有硬皮病表型的成纖維細(xì)胞也成為系統(tǒng)性硬皮病研究的最重要材料之一。但是，并不是所有來自患者皮損的成纖維細(xì)胞均表現(xiàn)出硬皮病表型，而目前極少前瞻性的資料可協(xié)助研究者預(yù)估皮損成纖維細(xì)胞硬皮病表型的發(fā)生概率。因此，我們開展前瞻性研究對系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞表型進(jìn)行Logistic回歸分

4、析，尋找相關(guān)的預(yù)測因子，建立預(yù)測模型。 方法：招募15名系統(tǒng)性硬皮病患者，記錄其臨床與實(shí)驗(yàn)室資料，進(jìn)行Rodnan皮損評分(TSS)、病情活動度評分(VDAI)、病情嚴(yán)重度評分(MDSS)等評估，進(jìn)行組織HE染色病理檢查，同時通過原代培養(yǎng)建立皮損成纖維細(xì)胞系。采用實(shí)時定量RT—PCR檢測成纖維細(xì)胞前膠原蛋白1α2轉(zhuǎn)錄水平。最后，使用Logistic回歸分析各細(xì)胞系資料。 結(jié)果：8例系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞系表現(xiàn)出膠原分泌過

5、高的硬皮病表型。Logistic回歸分析得出模型Y＝—9.718+2.525X7，X7代表病情活動度評分(VDAI)。組織病理結(jié)果顯示，系統(tǒng)性硬皮病表型與血管周圍白細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論：建立了系統(tǒng)性硬皮病患者皮損成纖維細(xì)胞表型預(yù)測模型Y=—9.718+2.525X7。本實(shí)驗(yàn)顯示系統(tǒng)性硬皮病皮損成纖維細(xì)胞表型與病情活動度呈正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)研究者欲獲得具有硬皮病表型的成纖維細(xì)胞系時，可利用該模型進(jìn)行評估，以預(yù)先估計高膠原分泌成

6、纖維細(xì)胞系的發(fā)生概率。 第三章系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞甲基化相關(guān)因子的表達(dá)和5-氮雜—2-脫氧胞苷對系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞膠原蛋白及相關(guān)因子表達(dá)的影響 背景與目的：近年來，表觀遺傳學(xué)中的DNA甲基化等成為許多生命科學(xué)研究的前沿與熱點(diǎn)，在硬皮病等多基因疾病的相關(guān)研究中顯示出巨大潛力。本實(shí)驗(yàn)擬檢測系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞甲基化相關(guān)因子的表達(dá)情況，探討5-氮雜—2-脫氧胞苷對系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞膠原蛋白及相關(guān)因子表達(dá)的影響。

7、 方法：采用實(shí)時定量RT—PCR技術(shù)，分別測定系統(tǒng)性硬皮病組和對照組皮膚成纖維細(xì)胞系甲基化相關(guān)因子Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、MBD1、MBD2、MeCP2、Kaiso等的mRNA表達(dá)水平；然后，使用甲基轉(zhuǎn)移酶5-氮雜—2-脫氧胞苷對體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行72小時干預(yù)；最后，檢測系統(tǒng)性硬皮病組成纖維細(xì)胞在5-氮雜—2-脫氧胞苷干預(yù)前后Collα2、TGF—β1、Smad7等基因mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：與健

8、康對照組比較，系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞Dnmt1、Collα2、TGF—β1基因mRNA表達(dá)增高，Smad7基因mRNA表達(dá)減少(P<0.05)。5-氮雜—2-脫氧胞苷處理后，系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞Collα2、TGF—β1基因轉(zhuǎn)錄水平回落，而Smad7基因表達(dá)也上升至正常范圍。 結(jié)論：系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞存在甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)異常，Dnmt1等表觀遺傳機(jī)制可能參與了系統(tǒng)性硬皮病發(fā)病過程，Dnmt1抑制劑5-氮雜—2-脫氧胞苷可能成

9、為系統(tǒng)性硬皮病治療的新選擇。 第四章系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞Smad7基因啟動子甲基化狀態(tài)的相關(guān)性研究 背景與目的：前階段研究顯示，系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶1表達(dá)增高；當(dāng)使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜—2-脫氧胞苷對硬皮病成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)時，原本低表達(dá)的Smad7基因出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄增加，同時膠原蛋白與TGF表達(dá)回落。研究提示系統(tǒng)性硬皮病Smad7基因低表達(dá)的致病機(jī)制可能有甲基化過程參與。因此，本階段實(shí)驗(yàn)擬檢測系統(tǒng)性硬皮病

10、組與正常對照組Smad7基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，分析其與疾病發(fā)生的可能關(guān)系。 方法：首先，應(yīng)用MethPrimer軟件分析Smad7基因啟動子區(qū)域CpG位點(diǎn)分布情況，對CpG島進(jìn)行預(yù)測，同時設(shè)計引物。接著，采用巢式PCR和降落PCR技術(shù)，對重亞硫酸鹽修飾法處理的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后克隆測序，使用QUMA軟件分析結(jié)果。最后，甲基化特異性PCR(MSP)對多細(xì)胞系相應(yīng)CpG位點(diǎn)進(jìn)行檢測，實(shí)時定量RT—PCR檢測

11、各細(xì)胞系Smad7轉(zhuǎn)錄情況，分析可能關(guān)系。 結(jié)果：在Smad7啟動子-1～-1000bp區(qū)域預(yù)測到兩個甲基化島；重亞硫酸鹽測序PCR(BSP)檢測顯示系統(tǒng)性硬皮病組與健康對照組相應(yīng)啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)存在統(tǒng)計學(xué)差異，其中第—851，—819位CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)差異顯著，P<0.05；甲基化特異性PCR(MSP)顯示Smad7基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與Smad7基因的轉(zhuǎn)錄水平存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論：系統(tǒng)性硬皮病成纖維