RG108對(duì)水牛成纖維細(xì)胞甲基化水平及核移植胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、體細(xì)胞核移植技術(shù)在多年的研究發(fā)展中日益完善，但核移植效率仍然較低，限制了體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用。目前普遍認(rèn)為，核移植效率低主要是由于供體細(xì)胞核在卵母細(xì)胞中的去分化和重編程不完全。體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚常常表現(xiàn)為DNA甲基化水平過(guò)高。本研究擬通過(guò)探討新型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑RG108對(duì)水牛成纖維細(xì)胞甲基化水平及其核移植重構(gòu)胚發(fā)育的影響，探索一種能提高核移植效率的有效途徑。
　　 首先，探討了不同濃度DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑RG108對(duì)

2、水牛成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)特性、染色體倍性、DNA甲基化水平及DNMTs mRNA表達(dá)量的影響。第7代水牛成纖維細(xì)胞經(jīng)不同濃度RG108(0，5，10，20，100μmol/L)處理72h后，分別對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、染色體倍性及甲基化水平等進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果顯示：(1)經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞存活率并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度RG108處理的水牛成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組(0μmol/L)基本一致，各組間細(xì)胞的存活率沒(méi)有顯著下降現(xiàn)

3、象(P>0.05)；(2)細(xì)胞常規(guī)染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度組(0、5、10、20、100μmol/L)的細(xì)胞染色體非整二倍體百分比(10.3％、12.3％、10.3％、12.1％、12.6％)之間差異均不顯著(P>0.05)；(3)免疫熒光組化間接檢測(cè)水牛成纖維細(xì)胞5-甲基胞嘧啶的相對(duì)含量發(fā)現(xiàn)，隨著RG108處理濃度的升高，水牛成纖維細(xì)胞的熒光相對(duì)強(qiáng)度逐漸降低，其中添加20、100μmol/LRG108的兩個(gè)處理組與對(duì)照組差異顯著(

4、P<0.05)，但兩個(gè)處理組(20、100μmol/L)之間差異不顯著(P>0.05)；(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)結(jié)果顯示，濃度為10、20、100μmol/L的RG108都顯著下調(diào)細(xì)胞DNMT1mRNA的表達(dá)(P<0.05)，并以20μmol/L組最顯著，但RG108對(duì)DNMT3amRNA的表達(dá)沒(méi)有顯著性影響(P>0.05)。
　　 同時(shí)，探討了RG108處理水牛成纖維供體細(xì)胞對(duì)水牛體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚發(fā)育的影響

5、。使用20μmol/L RG108分別處理水牛成纖維供體細(xì)胞不同時(shí)間(0、24、48、72、96 h)后進(jìn)行體細(xì)胞核移植。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20μmol/LRG108處理供體細(xì)胞72 h可顯著提高核移植重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率(P<0.05)，而且其囊胚細(xì)胞數(shù)與IVF組的囊胚細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P>0.05)。
　　 以上結(jié)果表明：(1)適宜濃度(≤100μmol/L)的RG108對(duì)水牛成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、存活率及核型沒(méi)有顯著影響；(2)濃度