人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的轉(zhuǎn)染對牛耳成纖維細(xì)胞壽命及核移植的影響.pdf

1、由于成纖維細(xì)胞具有有限的分裂次數(shù)，在50PDs左右進(jìn)入衰老階段，80PDs左右進(jìn)入危機(jī)階段，細(xì)胞凋亡。所以成纖維細(xì)胞這種“短暫”的壽命，是無法滿足轉(zhuǎn)基因核移植的要求的，限制了在科研和實(shí)際當(dāng)中的應(yīng)用。作為轉(zhuǎn)基因核移植的供體細(xì)胞，至少要能存活到45PDs以上，這樣才能保證外源基因在細(xì)胞內(nèi)的整合和正常表達(dá)，以及其它為核移植的所作的前期準(zhǔn)備工作的順利完成。本試驗(yàn)將攜帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green nuorescent pr

2、otein，EGFP)報(bào)告基因和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcfiptase，hTERT)目的基因的質(zhì)粒PEGFPC1-hTERT通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入牛耳成纖維細(xì)胞，并考察其壽命以及對核移植的影響，為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物做準(zhǔn)備。 1、用含10％血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牛耳成纖維細(xì)胞，通過脂質(zhì)體Lipofactamine 2000將外源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT轉(zhuǎn)入牛耳成纖維細(xì)胞，用熒光

3、顯微鏡觀測EGFP的表達(dá)，用600 ug/mL G418篩選獲得陽性克隆，然后換為含300 ug/mL G418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)使陽性克隆得到擴(kuò)增。 2、獲得的陽性克隆提取RNA，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)電泳分析在443bp處出現(xiàn)目的條帶，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無目的條帶。轉(zhuǎn)染后的12代(TN12)和22代(TN22)細(xì)胞端粒酶活性檢測均呈陽性，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無端粒酶活性。 3、測定陽性細(xì)胞12代(TN12)和22代(

4、TN22)以及陰性細(xì)胞12代(N12)和22代(N22)的生長曲線與群體倍增次數(shù)進(jìn)行比較。群體倍增指數(shù)分別為4.14±0.13，3.27±0.09，3.14±0.06，2.06±0.05，TN22與N12差異不顯著(p>0.05)，TN12和N22與各組均差異顯著(p<0.05)。結(jié)果顯示陽性細(xì)胞生長速度明顯高于未轉(zhuǎn)染的陰性細(xì)胞，壽命延長，但只越過了衰老期(50PDs左右)，沒有越過危機(jī)期(80PDs左右)，不能永生化。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測