人胃癌細(xì)胞系端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的檢測.pdf

1、大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文人胃癌細(xì)胞系端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的檢測姓名：王亞東申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：張錦瑜20050601存在hTERT核心啟動(dòng)子基因序列改變。取卜2ug基因組DNA先后經(jīng)過堿變性、硫化與脫氨、純化與脫硫以及回收沉淀等步驟完成基因組DNA的亞硫酸化修飾；修飾后的DNA，分別應(yīng)用甲基化引物及非甲基化引物進(jìn)行甲基化特異性PCR(MSP)反應(yīng)，檢測hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況；PCR產(chǎn)物分別經(jīng)

2、2％、15％瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外透射反射儀上觀察結(jié)果，并將純化產(chǎn)物克隆后測序觀察CpG位點(diǎn)甲基化情況。結(jié)果：不同分化的胃癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞及正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、正常人淋巴細(xì)胞及正常人胚肺成纖維細(xì)胞均檢測出hTERT核心啟動(dòng)子基因序列，端粒酶陽性的胃癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞以及正常的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及端粒酶弱陽性的正常人淋巴細(xì)胞均可用甲基化引物擴(kuò)增出目的基因片段，而應(yīng)用非甲基化引物則無目的基因片段。與此相反，端粒酶陰性的正常人胚

3、肺成纖維細(xì)胞則只能用非甲基化引物擴(kuò)增出目的基因片段，三種引物的PCR產(chǎn)物克隆測序結(jié)果正確，并發(fā)現(xiàn)不同分化的胃癌細(xì)胞的hTERT啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化情況存在差別。結(jié)論：不同分化的胃癌細(xì)胞hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)域均存在甲基化，且甲基化程度不同，可能與細(xì)胞的分化程度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所檢測的端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞及人永生化細(xì)胞、弱陽性的淋巴細(xì)胞均存在不同程度hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，甲基化調(diào)控可能廣泛存在于端粒酶陽性的組織及細(xì)胞中，通過某些