小鼠體細(xì)胞核移植中不同去核方法及融合和培養(yǎng)條件對(duì)重構(gòu)胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、小鼠體細(xì)胞核移植技術(shù)不僅可以為研究動(dòng)物胚胎發(fā)育、細(xì)胞和組織分化、基因表達(dá)調(diào)控、核質(zhì)相互作用提供技術(shù)平臺(tái)，而且在建立人類疾病動(dòng)物模型方面也有著重要的作用和意義。本實(shí)驗(yàn)以B6D2F1品系小鼠的胎兒成纖維細(xì)胞和卵母細(xì)胞作為核、質(zhì)供體，通過不同去核方法、融合方案、體外培養(yǎng)條件以及PEG/DMSO和TSA等試劑的應(yīng)用，對(duì)小鼠體細(xì)胞核移植重構(gòu)卵去移核后的存活情況、電融合情況和激活后重構(gòu)胚的著床前發(fā)育情況進(jìn)行比較，篩選合適的實(shí)驗(yàn)條件，為本實(shí)驗(yàn)室小鼠體

2、細(xì)胞核移植技術(shù)的建立和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。結(jié)果如下： 一、持卵方法、去核針口徑對(duì)小鼠卵母細(xì)胞去移核效果的影響：(1)以改進(jìn)的雙持卵針法去移核后重構(gòu)卵的存活率(82.05﹪)極顯著高于傳統(tǒng)的單持卵針法(22.35﹪)(P＜0.01)；(2)以14～16μm內(nèi)徑組去核針去移核后重構(gòu)卵存活率為80.77﹪，顯著高于10～12μm組和20～22μm組(P＜0.05)。 二、PEG/DMSO對(duì)供核細(xì)胞的處理、不同的融合液、融合電參數(shù)

3、和細(xì)胞代次對(duì)融合率的影響：(1)以PEG/DMSO對(duì)供核細(xì)胞預(yù)處理5分鐘后所得融合率顯著高于同條件下未處理組(51.11﹪vs25.64﹪)(P＜0.05)；(2)融合液中含0.1g/LPVA的各組融合率均高于無(wú)PVA組；重構(gòu)卵在甘露醇濃度為0.32mol/L的融合液中的融合率(48.21﹪)高于其他甘露醇濃度組的融合率(27.78﹪，41.67﹪和30.11﹪)；(3)針狀電極融合槽的融合率(42.31﹪，43.13﹪)高于其他參數(shù)條

4、件相同時(shí)平行絲狀電極融合槽組(30.43﹪，33.33﹪)，其中又以在2000V/cm，20μs，2個(gè)脈沖時(shí)，交流電預(yù)處理30秒組最高(43.13﹪)；(4)供核細(xì)胞傳代一次后融合率隨著傳代次數(shù)的增加而下降。 三、TSA和培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)重構(gòu)胚體外發(fā)育率的影響：(1)組蛋白去乙?；敢种苿﹖richostatinA能夠提高重構(gòu)胚的發(fā)育率；(2)不同的體外培養(yǎng)系統(tǒng)(CZBG，KSOM，KSOM+Vero飼養(yǎng)層細(xì)胞)中，以KSOM體系培

5、養(yǎng)重構(gòu)胚時(shí)卵裂率(39.06﹪)高于其它組(34.14﹪，35.90﹪)，而KSOM+Vero飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中桑葚胚發(fā)育率(15.38﹪)高于其它組(8.54﹪，12.50﹪)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室采用雙持卵針法，內(nèi)徑14～16μm去核針可以獲得較高的去移核后重構(gòu)卵存活率；使用針狀電極融合槽，當(dāng)融合液中甘露醇濃度為0.32mol/L，并添加PVA時(shí)，在2000V/cm，20μs，2個(gè)脈沖，交流電預(yù)處理30s條件下可以得到相