人類體細(xì)胞核移植胚胎紡錘體形態(tài)及其相關(guān)蛋白的檢測.pdf

1、研究背景：核有絲分裂器蛋白(Nuclear Mitotic Apparatus Protein， NuMA)、紡錘體驅(qū)動蛋白(kinesin spindle protein， Eg5)及γ-tubulin在人類成纖維細(xì)胞增殖，人類卵母細(xì)胞成熟和人類體細(xì)胞核移植胚胎早期發(fā)育過程中起重要作用。NuMA是一種分子量為236-240kDa的大分子核蛋白，具有微管聚合作用，能使微管錨定于紡錘體極。Eg5是驅(qū)動蛋白家族成員之一，動力蛋白介導(dǎo)運(yùn)輸并定

2、位NuMA于紡錘體極，通過NuMA遠(yuǎn)端指導(dǎo)聚集微管蛋白。γ-tubulin是中心粒周圍物質(zhì)(Pericentriolar material, PCM)中一種具代表性的蛋白，具有起始微管晶核形成，調(diào)節(jié)紡錘體組裝的作用。相關(guān)研究證明上述任一種蛋白的缺失或過表達(dá)均可導(dǎo)致紡錘體形態(tài)異常，最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常。Simerly等在非人靈長類體細(xì)胞核移植實驗中發(fā)現(xiàn)，所檢測的體細(xì)胞核移植胚胎中NuMA缺失，驅(qū)動蛋白Eg5分布紊亂，紡錘體形態(tài)異常，因此作

3、者認(rèn)為，非人靈長類體細(xì)胞核移植實驗失敗的主要原因是由于卵母細(xì)胞去核過程中造成了NuMA及驅(qū)動蛋白Eg5損失。后來的研究顯示，大部分猴子體細(xì)胞核移植胚胎NuMA分布基本正常。人類不同成熟階段卵母細(xì)胞及體細(xì)胞核移植胚胎紡錘體及其相關(guān)蛋白分布如何?目前還未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。
　　 目的：為了尋求人類胚胎成纖維細(xì)胞、不同成熟階段人類卵母細(xì)胞及人類體細(xì)胞核移植胚胎紡錘體形態(tài)及其相關(guān)蛋白分布規(guī)律，探討人類卵母細(xì)胞去核過程中紡錘體及其相關(guān)蛋白的

4、損失是否是導(dǎo)致人類體細(xì)胞核移植效率低下的原因，以期解決人類體細(xì)胞核移植研究面臨的技術(shù)難題，加速人類治療性克隆應(yīng)用的步伐。
　　 方法：使用間接免疫熒光染色方法在普通熒光顯微鏡或激光共聚焦熒光顯微鏡下對人類胚胎成纖維細(xì)胞、不同成熟階段人類卵母細(xì)胞及人類體細(xì)胞核移植胚胎紡錘體及其相關(guān)蛋白分布進(jìn)行觀察。
　　 生發(fā)泡(Gv)期、MⅠ期的人類卵母細(xì)胞來源于中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院ICSI患者治療過程中廢棄的卵母細(xì)胞；MⅡ期人類

5、卵母細(xì)胞大部分來源于ICSI患者治療廢棄的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，另一部分來源于多囊卵巢(PCOS)患者穿刺治療捐獻(xiàn)的卵母細(xì)胞。人類胚胎成纖維細(xì)胞來源于人類干細(xì)胞國家工程研究中心。使用人類胚胎成纖維細(xì)胞為供核細(xì)胞，在偏振光顯微鏡下去除MⅡ期人類卵母細(xì)胞核，使用內(nèi)徑為8-10μm的顯微注射針將供核細(xì)胞顯微注射于去核的MⅡ期人類卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，體外化學(xué)激活(A23187聯(lián)合6-DMAP)后對人類體細(xì)胞核移植胚胎進(jìn)行G1.5/G2.5序貫培養(yǎng)。

6、
　　 結(jié)果：1、在人類胚胎成纖維細(xì)胞分裂間期及人類卵母細(xì)胞Gv期，NuMA分布于細(xì)胞核內(nèi)除核仁外的位置，α-tubulin呈網(wǎng)狀分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；人類胚胎成纖維細(xì)胞有絲分裂中期及人類卵母細(xì)胞MⅠ及MⅡ期，NuMA凝集分布于紡錘體兩極。
　　 2、在人類胚胎成纖維細(xì)胞有絲分裂間期，Eg5分布于核質(zhì)內(nèi)，γ-tubulin呈一凝集點狀分布于核膜附近：在人類胚胎成纖維細(xì)胞有絲分裂中期，Eg5及γ-tubulin均集中分布于紡錘體

7、兩極，Eg5在紡錘體中央?yún)^(qū)及細(xì)胞質(zhì)中也有分布。
　　 3、去核后人類卵母細(xì)胞胞質(zhì)未檢測到NuMA及α-tubulin的表達(dá)，去除的核胞體中染色后發(fā)現(xiàn)正常規(guī)則的紡錘體，人類卵母細(xì)胞染色體整齊排列在赤道板上，NuMA定位在紡錘體兩極。注入供核細(xì)胞后2小時（核移植胚胎激活前），供核細(xì)胞核出現(xiàn)成熟前染色體凝集，短暫紡錘體結(jié)構(gòu)形成，NuMA聚集于紡錘體兩極。原核形成時期，NuMA分布于除核仁外的核質(zhì)內(nèi)，α-tubulin分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；人

8、類體細(xì)胞核移植胚胎第一次有絲分裂中期，NuMA主要分布于紡錘體兩極。人類體細(xì)胞核移植發(fā)育阻滯胚胎可栓測到NuMA分布在間期細(xì)胞核內(nèi)。
　　 結(jié)論：在人類胚胎成纖維細(xì)胞分裂間期及人類卵母細(xì)胞Gv期NuMA分布于核質(zhì)內(nèi)，人類胚胎成纖維細(xì)胞分裂中期及人類卵母細(xì)胞MⅠ、MⅡ期NuMA分布于紡錘體兩極。在不同發(fā)育階段的人類體細(xì)胞核移植胚胎中可檢測到NuMA表達(dá)，細(xì)胞分裂間期，NuMA分布于核質(zhì)內(nèi)，α-tubulin分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞分裂