沙冬青ErbB3結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)化杏的研究.pdf

1、中國(guó)杏種資源豐富分布廣泛，由于北方春季有低溫和晚霜，容易使杏花、幼果受凍，產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益受到極大損失，因此選育高抗寒杏具有重要的意義。傳統(tǒng)的植物育種方法在改善植物耐寒性方面取得的成功非常有限，利用傳統(tǒng)方法選育抗寒杏，育種周期長(zhǎng)，且抗寒效果不顯著，且杏樹(shù)的抗寒研究多集中在抗寒生理方面。利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對(duì)杏進(jìn)行抗寒性選育，更具高效性和針對(duì)性，可以加速高寒杏新種質(zhì)的選育進(jìn)程。植物低溫條件下，體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與其抗寒性密切相關(guān)。沙冬青ErbB

2、3結(jié)合蛋白基因(AmEBP1)是沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus Cheng f.)中與低溫脅迫相關(guān)的基因，低溫條件下，能夠抑制植物細(xì)胞翻譯因子(eIF2a)的磷酸化，調(diào)控eIF2a的活性，保證蛋白質(zhì)的正常合成，從而提高植物抗寒能力。本研究以沙冬青總RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA第一條鏈為模板克隆了AmEBP1基因編碼區(qū)序列，通過(guò)酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建載體并轉(zhuǎn)化到杏幼胚中，經(jīng)幼胚培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性

3、能進(jìn)行了研究，為培育抗寒杏新種質(zhì)打下了基礎(chǔ)。主要研究如下：
　?、乓陨扯嗫俁NA為模板，RT-PCR方法克隆得到目的基因AmEBP1，PCR與測(cè)序結(jié)果表明，與GeneBank公布的AmEB P1的cDNA(DQ519359)序列長(zhǎng)度一致;
　　⑵構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-22b-AmEBP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌，0℃時(shí)轉(zhuǎn)化AmEBP1的大腸桿菌存活率是轉(zhuǎn)化空載體的3倍，可以看出，表達(dá)了AmEBP1的大腸桿菌具有明顯較強(qiáng)的抗寒性;

4、r>　?、谴蠊⑨酚竦?個(gè)早熟杏品種，不完全花比率差異顯著，其中以大果杏不完全花比率最低，僅為11.62％，紅荷包最高，高達(dá)80.91％，岱玉50.08％，金太陽(yáng)27.22％，新世紀(jì)25.43％;座果率大果杏最高可達(dá)29.34％，其次是金太陽(yáng)，岱玉坐果為7.23％，最低的為紅荷包;
　?、纫源蠊踊ㄆ诤?0d幼胚為材料，建立了杏幼胚培養(yǎng)體系。WPM培養(yǎng)基作為大果杏的基本培養(yǎng)基，蔗糖10g·L-1，瓊脂8 g·L-1，pH調(diào)至5.8

5、;幼胚誘導(dǎo)芽叢的培養(yǎng)基選擇WPM+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1;芽團(tuán)生根培養(yǎng)基宜選擇WPM+ NAA0.1mg·L-1+6-BA0.8 mg·L-1+IBA0.2mg·L-1培養(yǎng)基;
　?、蓸?gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-AmEBP1，利用花粉管通道與基因槍結(jié)合方法轉(zhuǎn)化大果杏，轉(zhuǎn)化后的幼胚材料先接種WPM+Kan50mg·L-1篩選后，轉(zhuǎn)移到WPM+6- BA0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L

6、-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化擴(kuò)繁，再將擴(kuò)繁材料轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)成苗;
　?、蕦PM+Kan50mg·L-1篩選后的材料進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到6個(gè)陽(yáng)性植株;進(jìn)一步Southern檢測(cè)得出此6株系分別出現(xiàn)1-3條雜交帶，Southern結(jié)果說(shuō)明AmEBP1基因已經(jīng)整合到這6個(gè)株系的基因組DNA中;將單拷貝轉(zhuǎn)基因株系1、6進(jìn)行RT-PCR結(jié)果顯示AmEBP1基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá);且多帶擴(kuò)繁后目的基因能穩(wěn)定存在芽切苗中;
　?、藢⑥D(zhuǎn)基

7、因陽(yáng)性株系1、6在分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽叢，再將芽叢切成帶個(gè)芽的芽團(tuán)PCR檢測(cè)，剔除陰性，繼續(xù)分化誘導(dǎo)到一定基數(shù)，在誘導(dǎo)生根成苗，進(jìn)行下一步抗寒試驗(yàn)?？购囼?yàn)結(jié)果顯示:相同低溫（-4和-8℃）條件下，轉(zhuǎn)基因植株均比對(duì)照表現(xiàn)出較高的成活率;隨著處理溫度的降低，轉(zhuǎn)基因株系REC與MDA含量始終低于對(duì)照植株，但可溶性蛋白含量明顯高于對(duì)照;轉(zhuǎn)基因植株的低溫半致死溫度(LT50)比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.13℃;抗寒試驗(yàn)的其他酶活、可溶性物質(zhì)的含量結(jié)果也說(shuō)