沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶(AmGS)基因轉(zhuǎn)化類茶植物紅葉石楠的研究.pdf

1、自然環(huán)境下，低溫脅迫是植物主要的環(huán)境災(zāi)害因素，也是許多農(nóng)作物區(qū)域性和季節(jié)性的限定因素，往往會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和作物生產(chǎn)率，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的植物育種方法在改善植物耐凍性方面具有一定的局限性，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對(duì)植物(尤其是木本植物)進(jìn)行抗凍性改良，具有高效性和針對(duì)性，可以加速高抗凍性植物新品種的選育進(jìn)程。
　　 沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶基因(galactinolsynthasegoneofAmmopiptanthu

2、smongolicus)AmGS是從抗寒性強(qiáng)、能忍耐冬季-30℃以下低溫的沙冬青中篩選得到。經(jīng)過RACE擴(kuò)增得到了AmGS基因的全長(zhǎng)cDNA序列。然后分別克隆到原核表達(dá)載體pET-22b和真核表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS中，建成了AmGS基因的細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pET-22b-AmGS和紅葉石楠遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pCAMBIA2300-AmGS。然后分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌和和紅葉石楠中，獲得了轉(zhuǎn)AmGS基因的大腸桿菌和轉(zhuǎn)A

3、mGS基因的紅葉石楠。初步篩選出抗寒性提高的轉(zhuǎn)基因紅葉石楠株系，為用基因工程技術(shù)對(duì)茶樹等常綠樹種進(jìn)行抗寒性改良提供了重要參考和技術(shù)儲(chǔ)備。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、通過AmGS基因的原核表達(dá)研究，AmGS基因成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，在低溫下轉(zhuǎn)基因大腸桿菌比轉(zhuǎn)化空載體的大腸桿菌存活率高，說明我們克隆到了預(yù)期的AmGS基因。
　　 2、建立了紅葉石楠高效再生體系，外植體應(yīng)選擇水培嫩芽，最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基：MS+6-BA1.0mg

4、/L+NAA0.1mg/L；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；莖段再生分化誘導(dǎo)：莖段平鋪在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)；生根培養(yǎng)：IBA濃度為生根限制因子，培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖10g/L。
　　 3、構(gòu)建了植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pCAMBIA2300-AmGS，研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后植株的死亡率、分化率、分化芽數(shù)、

5、芽苗長(zhǎng)度、芽苗顏色與遺傳轉(zhuǎn)化有關(guān)的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)浸染部位是最重要的影響因子，莖尖是最佳的浸染部位，確定了AmGS基因轉(zhuǎn)化紅葉石楠的轉(zhuǎn)化方案為：選取紅葉石楠組培苗莖尖，用攜帶pCAMBIA2300-AmGS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌原液(OD600≈0.4)的1/2濃度，浸染10min，然后水平放置于附加25mg/L乙酰丁香酮(AS)的MS分化培養(yǎng)基上，25℃下黑暗條件下共培養(yǎng)2d，轉(zhuǎn)入50mg/L卡那霉素濃度的MS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)。
　　

6、4、本研究中篩選得到32個(gè)抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因植株，取其中的R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12進(jìn)行了莖段再生分化培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)的第一代進(jìn)行PCR分析表明轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系有R6、R7、R8和R10。對(duì)R6、R7、R8和R10進(jìn)行Southern雜交分析表明，AmGS基因已經(jīng)整合到R6、R7和R8三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA中。對(duì)單拷貝的R6和R7進(jìn)行RT-PCR分析結(jié)果表明，導(dǎo)入的AmGS基因在轉(zhuǎn)基因植株中的轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。

7、　　 5、轉(zhuǎn)基因植株的遺傳傳遞和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在C1、C2和C3繼代植株中，個(gè)別植株出現(xiàn)過PCR陰性的結(jié)果，但從C4至C6繼代植株中都沒出現(xiàn)PCR陰性的植株，這表明C4以后的繼代植株基本趨向穩(wěn)定；也表明導(dǎo)入的AmGS基因在R6、R7兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中能穩(wěn)定地傳遞到后代轉(zhuǎn)基因植株中。
　　 6、抗凍表型分析表明，在不同低溫條件下，轉(zhuǎn)基因植株都比野生型植株表現(xiàn)出較高的存活率，抗寒能力明顯優(yōu)于野生型植株，說明導(dǎo)入的抗凍基因提高了

8、紅葉石楠的抗寒性。
　　 7、不同低溫處理下轉(zhuǎn)基因植株的生理生化指標(biāo)研究表明，低溫處理后兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)電導(dǎo)率升高的程度明顯低于野生型植株。R6株系的LT50是-12.93℃，R7株系的LT50是-12.63℃，野生型植株的LT50是-8.25℃，兩轉(zhuǎn)基因株系的LT50分別比對(duì)照下降了4.68℃和4.38℃，說明轉(zhuǎn)基因株系的抗寒能力有了明顯提高。
　　 轉(zhuǎn)基因紅葉石楠的可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸、MDA等的測(cè)定結(jié)

9、果也支持了轉(zhuǎn)基因植株在低溫處理后受到的危害減輕，從另一個(gè)方面反映了轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性得到了改良。
　　 8、轉(zhuǎn)AmGS基因紅葉石楠對(duì)土壤微生物影響的初步檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系的微生物類群主要有細(xì)菌、真菌和放線菌，以細(xì)菌為主要微生物群落。轉(zhuǎn)基因紅葉石楠根際的土壤微生物數(shù)量有變化，其中細(xì)菌菌群數(shù)量變化最大，但對(duì)總體組成影響不大，仍以細(xì)菌數(shù)量最多，真菌和放線菌次之；在細(xì)菌菌群中以芽孢桿菌屬的細(xì)菌為主。
　　 本研究