梅花肌醇半乳糖苷和棉子糖合成酶基因的克隆與功能初探.pdf

1、梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)原產(chǎn)我國(guó)南方地區(qū)，冬季低溫限制了其在北方地區(qū)的分布。棉子糖家族寡糖(RFOs)在植物體內(nèi)的積累能夠提高植物抵抗、適應(yīng)逆境的能力，是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，由蔗糖逐步疊加半乳糖基團(tuán)合成。肌醇半乳糖苷合成酶（GolS）和棉子糖合成酶（RS）是合成過(guò)程中的重要酶。為探索PmGolS和PmRS基因在響應(yīng)非生物逆境脅迫中的功能，本研究從‘雪梅’中克隆得到了5個(gè)PmGolS基因(Pm00

2、3196、Pm006697、Pm008430、Pm012900、Pm020004)和2個(gè)PmRS基因(Pm027594、Pm025896)，并構(gòu)建了相應(yīng)的超量表達(dá)載體;利用qRT-PCR檢測(cè)了它們?cè)跁円购头巧锬婢趁{迫下的表達(dá)模式;異源轉(zhuǎn)化擬南芥，鑒定轉(zhuǎn)化植株在非生物逆境脅迫下的抗性;同時(shí)，轉(zhuǎn)化梅花，獲得了正常生根的轉(zhuǎn)基因植株。主要結(jié)果如下:
　　1.PmGolS和PmRS基因的克隆與序列分析
　　根據(jù)‘雪梅’幼葉4℃低溫處

3、理下的基因表達(dá)譜和梅花基因組數(shù)據(jù)，克隆了5個(gè)PmGolS基因和2個(gè)PmRS基因。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn):不同物種間GolS同源蛋白的近緣性高于同一物種內(nèi)的不同GolS亞型，說(shuō)明，物種進(jìn)化可能發(fā)生在種內(nèi)GolS基因序列復(fù)制事件之后;RS同源蛋白進(jìn)化樹的分析結(jié)果與GolS一致。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn):PmGolS編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列高度保守，在第130個(gè)氨基酸左右都有錳結(jié)合元件DXD，在第270個(gè)氨基酸左右都有絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，且羧基末端都有一個(gè)特征

4、性的疏水性五肽(APSAA);而PmRS編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列保守性較低，但都具有KXD和RXXXD兩個(gè)保守催化域。
　　2.PmGolS和PmRS基因在晝夜及非生物逆境脅迫下的表達(dá)模式
　　以‘雪梅’幼葉為材料，利用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了5個(gè)PmGolS基因和2個(gè)PmRS基因晝夜及低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫下的表達(dá)豐度變化，結(jié)果表明:PmGolS基因中Pm003196存在明顯的晝夜表達(dá)規(guī)律，另外6個(gè)基因并無(wú)明顯的晝夜

5、表達(dá)規(guī)律;所有目的基因都不響應(yīng)ABA脅迫，但對(duì)另外三個(gè)非生物逆境脅迫各有不同程度的響應(yīng)，Pm003196、Pm006697、Pm025896響應(yīng)低溫脅迫，Pm008430、Pm027594、Pm025896響應(yīng)NaCl脅迫，Pm003196、Pm008430、Pm025896、Pm027594響應(yīng)甘露醇脅迫，Pm027594不響應(yīng)低溫脅迫，Pm012900、Pm020004在所有脅迫下表達(dá)量都很低。
　　3.PmGolS蛋白亞細(xì)胞

6、定位
　　構(gòu)建了PmGolS家族中的三個(gè)基因Pm003196、Pm008430、Pm006697相應(yīng)的YFP融合蛋白表達(dá)載體，對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果顯示，三種蛋白均分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中。
　　4.PmGolS和PmRS基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥及轉(zhuǎn)化植株的抗寒性分析
　　構(gòu)建了5個(gè)PmGolS基因和2個(gè)PmRS基因的超量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥。T1代擬南芥陽(yáng)性苗RT-PCR分析結(jié)果顯示，除Pm020004外，其

7、它基因均獲得高表達(dá)轉(zhuǎn)化株系。
　　對(duì)擬南芥T2代和野生型株系進(jìn)行低溫處理和電導(dǎo)率測(cè)定，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)PmGolS基因擬南芥株系的存活率和相對(duì)電導(dǎo)率與野生型株系沒(méi)有明顯差別;而轉(zhuǎn)PmRS基因擬南芥株系的存活率比野生型株系高，且相對(duì)電導(dǎo)率比野生型株系低;此外，轉(zhuǎn)Pm003196基因擬南芥高株系的種子在400mM甘露醇脅迫下的萌發(fā)率比野生型高。
　　5.PmGolS轉(zhuǎn)化梅花
　　PmGolS基因超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化梅花成熟胚子葉，