鏈霉菌微型轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、隨著天藍(lán)色鏈霉菌A3（2）和阿維鏈霉菌MA-4680的全基因組序列的發(fā)表，鏈霉菌的基礎(chǔ)研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代，大量新基因和功能未知基因的功能有待鑒定。大規(guī)模突變體庫的構(gòu)建是功能基因組研究的一個(gè)重要內(nèi)容，而利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行插入突變構(gòu)建突變體庫則是目前廣泛應(yīng)用的方法之一。 轉(zhuǎn)座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在鏈霉菌中應(yīng)用的大多數(shù)轉(zhuǎn)座子卻普遍存在轉(zhuǎn)座效率低下或操作繁瑣等缺點(diǎn)。僅有Tn4556及其衍生物和Tn5衍生轉(zhuǎn)座子能夠被應(yīng)用

2、于突變體庫的構(gòu)建和突變菌株的篩選。但是它們依然存在各種缺陷。 針對(duì)現(xiàn)有轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的一些缺陷，構(gòu)建了應(yīng)用于鏈霉菌中的攜帶微型轉(zhuǎn)座子mini-Tn4560A的質(zhì)粒載體pHL265。它攜帶的轉(zhuǎn)座酶基因tnpA位于轉(zhuǎn)座子mini-Tn4560A外部，轉(zhuǎn)座發(fā)生后，質(zhì)粒載體pHL265由于不具有鏈霉菌復(fù)制子而不能在宿主菌中存在，失去了轉(zhuǎn)座酶基因的微型轉(zhuǎn)座子理論上將不可能發(fā)生二次轉(zhuǎn)座；帶有大腸桿菌與鏈霉菌進(jìn)行屬間接合轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn)oriT，將

3、有利于轉(zhuǎn)座子載體通過接合轉(zhuǎn)移的方式從大腸桿菌導(dǎo)入到鏈霉菌中，大大降低了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中自體突變的可能；轉(zhuǎn)座子直接進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)座，省去用Tn5體外轉(zhuǎn)座時(shí)要構(gòu)建基因組文庫，再將體外轉(zhuǎn)座突變體庫重轉(zhuǎn)入鏈霉菌，篩選突變菌株的復(fù)雜過程。 利用該轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座篩選得到天藍(lán)色鏈霉菌M145的約1000株轉(zhuǎn)座突變株。其中不乏表型異常的菌株。選取其中的8株，經(jīng)Southern雜交驗(yàn)證可知該轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座基本具有隨機(jī)性；通過連續(xù)的松弛傳代培養(yǎng)可知該轉(zhuǎn)