呼吸道合胞病毒與肺炎支原體,四型人冠狀病毒流行病學(xué)分析及抗人3型腺病毒人源化中和抗體研發(fā).pdf

1、【目的】
　　深入了解廣州地區(qū)呼吸道合胞病毒(RSV)及肺炎支原體(MP)，四種不同亞型人冠狀病毒的流行病學(xué)情況及臨床特征，提高臨床診斷的確診率，并嘗試對鼠源單克隆雜交瘤細(xì)胞株3D7的抗HAdv-3中和抗體基因進(jìn)行人源化改造，為治療性抗體的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　一、采集2012年1月～2014年1月期間在廣州地區(qū)急性呼吸道疾病患兒(≤14歲)咽拭子標(biāo)本，提取標(biāo)本核酸，利用熒光定量PCR進(jìn)行RSV與MP檢測；

2、并對其流行特征進(jìn)行分析。
　　二、采集2009年7月1日～2016年6月30日廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院患有急性呼吸道感染的兒科住院患兒的咽拭子標(biāo)本，共11399例。采用了熒光定量PCR方法對上述標(biāo)本進(jìn)行4種人類冠狀病毒(Coronavirus,HCoV)檢測，包括HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-OC43和HCoV-HKU1，隨后取出人冠狀病毒陽性標(biāo)本進(jìn)行11種常見呼吸道病毒檢測。并對其流行

3、特征進(jìn)行分析。
　　三、利用TRIzoL裂解分泌抗HAdv-3鼠源性單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細(xì)胞株3D7提取全RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用多條特異性簡并引物通過PCR擴(kuò)增鼠源性mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)基因。把鼠源性mAb輕鏈可變區(qū)基因及重鏈可變區(qū)基因分別克隆至Pa-L5(含人輕鏈信號肽及人輕鏈恒定區(qū)基因)構(gòu)建L鏈，克隆至Pa-H2(含有人重鏈信號肽及人重鏈恒定區(qū)基因)構(gòu)建H鏈，然后把L鏈通過基因擴(kuò)增酶切克隆至Pc-DNA

4、3.1(+)中，構(gòu)建pcDNA3.1-3D7L載體，把H鏈通過基因擴(kuò)增酶切克隆至Pc-DNA3.1(+)中，構(gòu)建pcDNA3.1-3D7H載體。把pcDNA3.1-3D7L與pcDNA3.1-3D7H質(zhì)粒以1：1比例共同轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)及構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　【結(jié)果】
　　一、在3760例患兒中，檢出RSV392例，陽性率為10.4％；檢出MP339例，陽性率9.0%。在RSV陽性病例中，年齡在0～9個(gè)月患兒最高，

5、達(dá)19.6%(181/923例)。RSV流行高峰發(fā)生于2012年2月～4月和2013年1月～4月，陽性率分別為26.8%(136/507例)和18.0%(151/839例)。在MP陽性病例中，年齡在6～10歲陽性率最高，達(dá)20.1%(97/484例)，MP流行高峰發(fā)生在2012年7月～10月和2013年6月～10月，陽性率分別為16.3%(92/564例)和13.4%(124/922例)。在上呼吸道癥狀中，RSV感染患兒鼻塞[28.6%

6、(112/392例)]、流涕[33.2%(130/392例)]發(fā)生率顯著高于MP陽性患兒[15.0%(51/339例)、20.6%(70/339例)]，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.001)；RSV感染患兒咳嗽[78.1%(306/392例)]、咳痰[20.4%(80/392例)]發(fā)生率顯著低于MP陽性患兒[90.0%(305/339例)、27.1%(92/339例)]，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001,P=0.032

7、)。在下呼吸道癥狀中，RSV陽性患兒氣喘[33.2%(130/392例)]、氣促[13.5%(53/392例)]、喘鳴音[29.3%(115/392例)]、痰鳴音[18.9%(74/392例)]發(fā)生率顯著高于MP陽性患兒[11.5%(39/339例)、6.5%(22/339例)、11.5%(39/339例)、10.6%(36/339例)]，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001,P=0.002,P＜0.001,P=0.002)。MP

8、陽性患兒雙肺呼吸音粗[59.2%(201/339例)]較RSV陽性患兒[40.1%(157/392例)]更為多見，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　二、總HCoV陽性率為4.3%(489/11399)，OC43陽性率為3.0%(346/11399)，229E陽性率為0.6%(65/11399)，NL63陽性率為0.5%(60/11399)，HKU1陽性率為0.3%(38/11399)，其中一些患兒存在共感染多型HC

9、oV的情況。總HCoV陽性率在所有年齡組中在3.3%～5.5%之間?？侶CoV和OC43在7~12個(gè)月的年齡段的患兒比例顯著最高(p＜0.001)?？侶CoV、OC43、229E、NL63和HKU1陽性率最高的月份分別出現(xiàn)在2012年四月(15.3%,25/163)、2012年四月(14.1%,23/163)、2011年二月(10.4%,8/77)、2009年九月(7.7%,3/39)和2010年六月(6.2%,5/81)。而在臨床癥狀

10、上分析，只感染一種HCoV的患兒癥狀與共感染其他HCoV分型及其他常見的呼吸道病毒患兒癥狀作對比，只感染一種HCoV的患兒高熱(≥38℃)(p=0.014)和不正常肺呼吸(p=0.043)癥狀明顯比共感染其他 HCoV分型及其他常見的呼吸道病毒的患兒多。另外，在HCoV4種分型的患兒癥狀對比，咳嗽(p=0.032)，肺炎(p=0.026)，不正常肺呼吸(p=0.002)癥狀呈顯著差異。在HCoV陽性患兒共感染病例中，出現(xiàn)最普遍的呼吸道病

11、毒是流感病毒A型(21.6%,50/231)和呼吸道合胞病毒(21.6%,50/231)。
　　三、經(jīng)過3輪單克隆篩選，CLEIA結(jié)果顯示抗體表達(dá)水平達(dá)到20mg/L，通過western blotting檢測到有完整的抗體分子表達(dá)并且抗體結(jié)構(gòu)正確，經(jīng)體外微量中和實(shí)驗(yàn)檢測該抗體有中和活性。
　　【結(jié)論】
　　一、廣州地區(qū)RSV的主要感染人群是0～9個(gè)月的兒童，重點(diǎn)在每年1月～4月；MP的主要感染人群是6～10歲的兒童，重

12、點(diǎn)在每年6月～10月。預(yù)防工作要全年進(jìn)行，預(yù)防因RSV和MP感染導(dǎo)致的住院率增高。
　　二、廣州地區(qū)總HCoV主要感染人群是7～12個(gè)月的年齡段的兒童，重點(diǎn)防控時(shí)間在春季及秋季。其中，OC43主要感染人群是7～12個(gè)月的年齡段的兒童，重點(diǎn)防控時(shí)間在春季及秋季，229E主要感染人群是4～6個(gè)月的年齡段的兒童，重點(diǎn)防控時(shí)間在春季，NL63主要感染人群是7～12個(gè)月的年齡段的兒童，重點(diǎn)防控時(shí)間在秋季，而HKU1重點(diǎn)防控時(shí)間在夏季。