廣州兒童呼吸道病原體流行與氣候相關(guān)性及呼吸道合胞病毒診斷技術(shù)研究.pdf

1、目的：
　　急性呼吸道感染（ARI）一直是困擾人類最常見、發(fā)生率最高的疾病，其病原復(fù)雜多樣，且很難從癥狀上判斷感染種類。廣州由于其特殊的地理位置，濕熱的氣候，緊鄰東南亞，國內(nèi)外人員活動頻繁的特點一直是各種呼吸道病原體的活動溫床，而呼吸道病原體的精確診斷和流行病學(xué)研究對疾病防治具有重要意義。
　　方法：
　?。?）本研究采集2009.7至2016.6廣州ARI患者（≤14歲）咽拭子，采用熒光定量PCR方法檢測18種常見呼

2、吸道病原體，并收集期間廣州氣象數(shù)據(jù)包括月平均氣溫、平均相對濕度、平均風(fēng)速，平均氣壓、平均水汽壓及日照時數(shù)，分析病原體在廣州地區(qū)的流行規(guī)律及其與氣候因素的相關(guān)性；
　　（2）根據(jù)RSV M2-1轉(zhuǎn)錄抗終止因子作用，將M2-1克隆至pcDNA3.1(+)，通過轉(zhuǎn)染、篩選獲得穩(wěn)定表達M2-1的Hep-2細胞株，并對穩(wěn)定表達細胞株的生長特性及RSV感染特性進行分析；
　　（3）以Taqman熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以RSV-A、R

3、SV-B的G基因特異保守區(qū)、管家基因ACTB設(shè)計引物探針建立多重?zé)晒舛縋CR，通過多種呼吸道病原體驗證其特異性，以體外轉(zhuǎn)錄的RNA驗證其靈敏度并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。對2013.1至2015.12期間廣州ARI患者（≤14歲）咽拭子進行RSV-A、RSV-B檢測并收集病歷信息，首次采用相對病毒載量 CVL方法進行呼吸道樣品的病毒定量，分析廣州地區(qū)感染RSV-A/RSV-B的流行狀況及患者臨床表現(xiàn)，探討利用內(nèi)參基因進行相對定量分析的可行性。

4、r>　　結(jié)果：
　?。?）本研究在七年間收集11399例ARI患者咽拭子，對其進行18種常見呼吸道病原體檢測。49.2％（5606/11399）的患者檢測出一種或多種病原體陽性，在陽性患者中，檢出率最高的為 RSV（1690/5606,30.1%）、infA（839/5606,15.0%）、MP（760/5606,13.6%）、ADV（621/5606,11.1%）、HRV（402/3789,10.6%），接著是OC43、HMPV

5、、infB、PIV3、HBoV，陽性率6.2%-4.4%，剩余的7種病原體PIV1，CP，PIV2，229E， NL63，HKU1，PIV4的陽性率均低于4.0%。病原體在不同年齡患者中分布有四種模式：1）陽性率隨著年齡的增大而減少，包括RSV（p＜0.001）；2）隨著年齡增大而增多，包括infA和infB（p＜0.001）；3）在0-14歲患者中發(fā)現(xiàn)感染高峰，包括EV、HRV、ADV、MP、PIV3、OC43、HBoV、HMPV（p

6、≤0.025）；4）無顯著差異或者數(shù)量太少無法統(tǒng)計，包括PIV1、PIV2、PIV4、229E、NL63、HKU1、CP?？傮w來說，隨著季節(jié)更替時，樣本陽性率升高或降低：1）陽性率升高：在6-9月份之間（夏轉(zhuǎn)秋）及4-5月份（春轉(zhuǎn)夏）常有陽性率的高峰；2）陽性率降低：在10-12月份之間（秋轉(zhuǎn)冬）及1-3月份（冬轉(zhuǎn)春）常有陽性率低谷。通過多元線性回歸分析，有顯著線性關(guān)系的有：標(biāo)本陽性率與平均氣溫、平均相對濕度、日照時數(shù)（p≤0.002）

7、，RSV與平均相對濕度、日照時數(shù)（p≤0.034），MP與平均氣溫（p=0.003），ADV與日照時數(shù)（p=0.008），EV與平均氣溫、平均相對濕度（p≤0.039），HMPV與日照時數(shù)（p=0.004），PIV3與平均氣溫、平均相對濕度、日照時數(shù)（p≤0.049），HBoV與平均氣溫、平均相對濕度（p≤0.024）。
　?。?）本研究通過pcDNA3.1(+)質(zhì)粒構(gòu)建攜帶M2-1載體，轉(zhuǎn)染并通過篩選獲得穩(wěn)定表達RSV M2-1

8、的Hep-22F5細胞，通過對比Hep-22F5與原始Hep-2細胞的生長曲線及培養(yǎng)觀察，Hep-22F5增殖速度高于Hep-2；通過對比Hep-22F5與原始Hep-2細胞感染RSV的特點，發(fā)現(xiàn)Hep-22F5對RSV更加敏感，更加易感，但其病毒產(chǎn)量低于原始Hep-2細胞。
　　（3）本研究根據(jù)RSV-A和RSV-B的G基因特異保守區(qū)及ACTB基因建立了多重?zé)晒舛繖z測方法，使用一系列呼吸道病原體檢測無非特異性擴增，RSV-A、

9、RSV-B、ACTB可分別檢測到最低4 copies/μl、8 copies/μl和12 copies/μl的體外轉(zhuǎn)錄RNA模板，并且分別在10–1×1010 copies/μl（r2=0.9973）、100–1×1010 copies/μl（r2=0.9989）和100–1×1010 copies/μl（r2=0.9984）的RNA模板濃度范圍內(nèi)具有很好的線性。在三年時間共收集、檢測5483例ARI患者（≤14歲），總?cè)藬?shù)13.3%（

10、729/5483）的患者為RSV陽性，其中RSV-A、RSV-B分布占51.2%（373/729）和48.8%（356/729）。在2013和2015年各年份主要流行亞型分別為RSV-B和RSV-A，而2014年則是兩種亞型都有流行。在臨床表現(xiàn)上，在RSV-A和RSV-B陽性患者之間發(fā)現(xiàn)在流涕、呼吸困難、細支氣管炎、寒戰(zhàn)、頭疼、肌痛、乏力、嘔吐、納差、腹瀉、皮疹等（p≤0.01）臨床癥狀的發(fā)生頻率上有顯著差異。不同的RSV CVL患者主

11、要在細支氣管炎、發(fā)熱（≥38℃）（p≤0.009）的發(fā)生頻率上有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　（1）本次研究通過在廣州對14歲以下ARI患者18種常見呼吸道病原體及其亞型的七年監(jiān)測分析：1）了解了當(dāng)?shù)爻Ｒ姾粑啦≡w的分布構(gòu)成情況；2）獲得了常見呼吸道病原體在14歲以下患者這個的年齡分布模式；3）獲得了當(dāng)?shù)睾粑啦≡w的季節(jié)分布特點及其與氣候因素的相關(guān)性。
　?。?）本研究根據(jù)其M2-1的功能：1）以Hep-2為基礎(chǔ)構(gòu)建

12、成功穩(wěn)定表達M2-1的Hep-22F5；2）獲得了Hep-22F5的生長特點、RSV感染特點；3）為RSV培養(yǎng)分離提供備選細胞。
　?。?）本研究根據(jù)RSV亞型基因特點及管家基因ACTB：1）建立了新型的RSV亞型多重?zé)晒舛縋CR診斷方法；2）獲得廣州RSV-A、RSV-B的流行病學(xué)資料；3）首次提出使用CVL評價方法進行呼吸道樣品中的病原體定量。
　　本研究在病原體快速診斷、培養(yǎng)分離和流行病學(xué)的工作希望為疾病的防治、臨床