丹參在全胃腸外營養(yǎng)致肝損害中的作用及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、1．研究背景: 臨床上許多危重患者由于不能從胃腸道攝取充足的營養(yǎng)而導(dǎo)致營養(yǎng)不良，從而影響對疾病的治療，而全胃腸外營養(yǎng)（Total Parenteral Nutrition，TPN）作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一項(xiàng)新成就，集治療、營養(yǎng)、藥理、藥劑、代謝調(diào)理和內(nèi)分泌學(xué)為一體，應(yīng)用于危重患者和無口服功能者，對外科和內(nèi)科等多種疾病給予營養(yǎng)支持，使這些疾病的治療取得了進(jìn)展。但隨著TPN臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，并發(fā)癥也日益增多，尤其是長期應(yīng)用者更容易發(fā)生。肝

2、損害就是應(yīng)用TPN常見的并發(fā)癥之一。國外報道長期TPN引起的肝功能損害發(fā)生率高達(dá)84%。病理生理上，肝損害在成人主要表現(xiàn)為脂肪變性，而在新生兒主要表現(xiàn)為膽汁淤積。國內(nèi)也提到了全胃腸外營養(yǎng)致肝損傷包括：肝功能異常、肝脂肪變性、膽汁淤積、慢性肝病等4個主要的方面。TPN期間，膽汁流動下降已為多項(xiàng)研究所證實(shí)。對于其發(fā)病機(jī)制，目前研究說法不一，但并非單一因素所致。有研究認(rèn)為與禁食時間、營養(yǎng)成分及其比例等因素有關(guān)，如禁食導(dǎo)致腸液、膽汁、胰液分泌異

3、常，縮膽素分泌減少，營養(yǎng)成分的高糖和高蛋白對肝臟不利等。另有研究表明氧化損傷及肝細(xì)胞調(diào)亡均與TPN肝損害有關(guān)。近幾年來國外學(xué)者對此項(xiàng)研究又做了更深一步的探討，如Tazuke Y等從肝細(xì)胞分裂周期及肝臟P-糖蛋白的變化等方面來研究TPN致肝損害。縱觀國內(nèi)外研究資料，尚無從相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)方面進(jìn)行研究的。如何更好地發(fā)現(xiàn)并防止TPN對機(jī)體的損害，到目前為止，還有待于進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究。 丹參作為臨床常用的藥物之一，含有多種藥理活

4、性成分，具有廣泛而復(fù)雜的藥理作用，在治療肝臟疾病方面具有很大潛力。大量臨床和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，丹參對肝臟具有抗肝纖維化，提高供體肝臟的保存效果，消除肝細(xì)胞氧自由基，減輕肝臟冷熱缺血再灌注后的損害，減輕肝細(xì)胞脂肪變性和壞死，促進(jìn)殘肝再生，防治肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及影響肝硬化門靜脈高壓血流動力學(xué)等作用。動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，丹參通過抗氧化和調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而達(dá)到對抗TPN所致肝損害的作用。丹參用于臨床TPN致肝損傷的防治具有重要的意義，其作用機(jī)制

5、仍有待深入研究。 蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因時代的產(chǎn)物，在生命科學(xué)研究中越來越體現(xiàn)出其重要性和優(yōu)越性。疾病的外在表現(xiàn)以其相應(yīng)的內(nèi)在物質(zhì)改變?yōu)榛A(chǔ)，而這種物質(zhì)的執(zhí)行者就是蛋白質(zhì)。一個或者多個蛋白質(zhì)，或是結(jié)構(gòu)的變化，或表達(dá)量的改變，才導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。通過蛋白質(zhì)組的研究，比較不同狀態(tài)的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，從蛋白質(zhì)量和結(jié)構(gòu)變化兩方面來觀察其功能變化，從而了解機(jī)體內(nèi)部復(fù)雜的生理、病理過程?，F(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)廣泛運(yùn)用于疾病的早期診斷、

6、治療；尋找疾病的特異蛋白質(zhì)標(biāo)記物；探討某些重大疾病的產(chǎn)生過程和機(jī)制等。總之，蛋白質(zhì)組學(xué)研究是直接從蛋白質(zhì)著手來探討疾病發(fā)生過程中蛋白質(zhì)種類及數(shù)量的變化，而蛋白質(zhì)是廣泛參與細(xì)胞的功能與調(diào)節(jié)并決定細(xì)胞、組織和器官的基本單位。這與丹參對肝臟作用的多靶點(diǎn)性是密切相聯(lián)的。因此，它為肝臟疾病分子機(jī)制的研究提供了一個可行的方法，有利于闡明疾病的發(fā)病機(jī)理并提供新的治療靶點(diǎn)。 2．研究目的: 隨著TPN在臨床上的廣泛應(yīng)用，在發(fā)揮它積極作用

7、的同時，它的副作用也引起了人們的關(guān)注。TPN在臨床上導(dǎo)致的肝損傷主要包括：肝功能異常、肝脂肪變性、膽汁淤積、慢性肝病等4個主要的方面。本研究以臨床需要TPN的急性胰腺炎患者為研究對象，研究丹參在TPN致肝損傷中的作用，同時運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，期待能從機(jī)體功能執(zhí)行者——蛋白質(zhì)的角度，通過對比給予TPN、丹參治療后血清中蛋白質(zhì)，綜合有表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，尋找與丹參防治TPN致肝損害相關(guān)的蛋白質(zhì)組群，并對其中某些蛋白質(zhì)進(jìn)行功能研究，從蛋白質(zhì)組的

8、角度探討中藥丹參發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)理所在。為更好的防治TPN副作用的發(fā)生以及發(fā)揮中醫(yī)中藥在臨床中的重要作用打下良好的理論基礎(chǔ)。 3．研究方法: 本研究以臨床需要TPN的急性胰腺炎患者為研究對象，建立納入標(biāo)準(zhǔn)，篩選出進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的臨床病例。篩選出的28例AP患者，隨機(jī)分為對照組（B）和治療組（C）各14例。在AP常規(guī)治療基礎(chǔ)上，對照組給予靜脈置管全胃腸外營養(yǎng)，治療組在全胃腸外營養(yǎng)的基礎(chǔ)上給予注射用丹參粉針400mg（哈藥集團(tuán)

9、中藥二廠批準(zhǔn)文號：210970093加入5%GS250ml中靜脈滴注，1次/日）。均在TPN或（TPN+丹參）后采取全血。觀測臨床肝功（ALT、AST、TBiL、DBiL、ALP）指標(biāo)，研究丹參在TPN致肝損害中的作用。 收集的全血經(jīng)低溫分離，分離后的血清用2D-Quant Kit蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。定量后采用雙向電泳技術(shù)分離血清蛋白，一向采用IPG3-10L、24cm膠條進(jìn)行水平的等電聚焦，二向進(jìn)行SDS-PAGE垂直

10、電泳。電泳結(jié)束后用采用膠體銀染技術(shù)，利用Umax PowerLook 1100投射掃描儀采集圖像。采用Bio-Rad二維圖譜分析軟件PDQuest 8．0進(jìn)行圖像分析，軟件自動給出差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)據(jù)信息。切取部分差異明顯的蛋白點(diǎn)送香港大學(xué)基因研究中心進(jìn)行鑒定，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，采用Swissprot軟件在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，鑒定差異蛋白?？紤]到臨床影響因素較多，故最后加以動物實(shí)驗(yàn)研究TPN對肝臟的損害作用及丹參在其中的作用。

11、 動物實(shí)驗(yàn)中24只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為正常組、TPN組、TPN+丹參組。正常組自由進(jìn)食飲水；TPN組給予全胃腸外營養(yǎng)，禁食禁水；TPN+丹參組在TPN基礎(chǔ)上給予丹參注射液治療（0．2ml/kg）。三組均進(jìn)行實(shí)驗(yàn)7d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時采血標(biāo)本，用自動生化分析儀測肝功能。 4．結(jié)果: (1) 通過對臨床病例的篩選，選出了28例符合入選標(biāo)準(zhǔn)的病例。 (2) 短期的TPN治療也會導(dǎo)致輕度的肝損傷，以ALT

12、和ALP升高為主，而給予丹參則會減輕肝損傷。 (3) 獲得了較為滿意的血清蛋白質(zhì)組2-DE凝膠電泳圖像。TPN及丹參均能干預(yù)TPN肝損害血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜。 (4) 部分差異蛋白點(diǎn)的鑒定。對所獲得的部分差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析后獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，再經(jīng)Swissprot搜索數(shù)據(jù)庫成功鑒定出其中5個蛋白質(zhì)，它們分別為血清白蛋白前體（Serum albumin precursor）、接聯(lián)球蛋白（Haptoglobin pr

13、ecursor）、免疫球蛋白κ鏈C區(qū)（Ig kappa chain C region）、補(bǔ)體C4-B前體（Complement C4-B precursor）和血清鐵傳遞蛋白前體（Serotransferrin precursor）。 (5) 動物實(shí)驗(yàn)表明，全胃腸外營養(yǎng)可對肝功造成一定的損害，而丹參對這種損害有一定的保護(hù)作用，與正常對照組比較，TPN組ALT、AST、TBiL、DBiL、r-GT、ALP均有顯著性差異（P<0．0

14、1）。與TPN組比較，TPN+丹參組ALT、DBiL、r-GT、ALP有顯著性差異（P<0．05），而AST、TBiL無顯著性差異。 5．結(jié)論: 本研究首次運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對丹參在全胃腸外營養(yǎng)致肝損害中的作用進(jìn)行研究。通過建立納入標(biāo)準(zhǔn)，篩選出進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的臨床病例，觀測臨床肝功指標(biāo)，研究丹參對TPN致肝損害的作用。采用2-DE聯(lián)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，對分離后的血清進(jìn)行分析，分離并鑒定出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)功能主要

15、涉及營養(yǎng)物質(zhì)代謝、免疫等方面，表明全胃腸外營養(yǎng)導(dǎo)致的肝損害和其組成成分的作用是有很大關(guān)聯(lián)的。 通過本次研究發(fā)現(xiàn)： 1、短期的TPN治療也會導(dǎo)致輕度的肝損傷，以ALT和ALP升高為主，而給予丹參則會減輕肝損傷。 2、TPN及丹參均能干預(yù)TPN肝損害血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜。丹參可能通過下調(diào)血清鐵傳遞蛋白前體和上調(diào)免疫球蛋白κ鏈C區(qū)和補(bǔ)體C4-B前體來參與防治TPN對肝臟的損害。 3、動物實(shí)驗(yàn)表明TPN確實(shí)能導(dǎo)致肝功