Vero細(xì)胞乙型腦炎滅活疫苗制備過程中制造工藝及檢定技術(shù)的優(yōu)化.pdf

1、目的：為了提高產(chǎn)品的質(zhì)量，制造出更經(jīng)濟(jì)、更安全、更有效乙型腦炎滅活疫苗，我們從生產(chǎn)和檢定兩個(gè)方面著手：一是簡化生產(chǎn)程序，優(yōu)化制備疫苗過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，選擇最簡單、最便宜又高效的方式方法進(jìn)行生產(chǎn)，使乙腦疫苗更加安全、有效，且價(jià)格更便宜；二是完善檢定技術(shù)，尋找最合適檢測方法，減少干擾因素，使檢測方法簡單，條件易于控制。制定嚴(yán)格的操作規(guī)程，使檢定結(jié)果最接近真實(shí)值，更能體現(xiàn)疫苗的真實(shí)情況，制造出更安全的人用乙型腦炎疫苗。
　　 方法：<

2、br>　　 1．復(fù)蘇Vero細(xì)胞，并在細(xì)胞瓶中傳代、擴(kuò)增，建立主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫。
　　 2．將乙腦病毒鼠腦P3株感染Vero細(xì)胞，制備乙型腦炎病毒Vero細(xì)胞P3株（P3MV株），建立主種子批和工作種子批。
　　 3．用乙型腦炎病毒P3MV株接種Vero細(xì)胞，在適宜溫度下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到+++～++++時(shí)，收獲病毒液。
　　 4．將收獲的病毒液合并、滅活、濃縮、純化，經(jīng)稀釋制備成乙腦疫苗成品，再分裝、凍

3、干。
　　 5．按照《中國藥典三部》2005版的要求，對制備疫苗的各個(gè)環(huán)節(jié)及半成品、成品進(jìn)行檢定。
　　 結(jié)果：
　　 1．?dāng)U增細(xì)胞，經(jīng)過傳代擴(kuò)增，將Vero細(xì)胞131代定為主細(xì)胞庫，135代為工作細(xì)胞庫；
　　 2．制備毒種庫，乙型腦炎病毒Vero細(xì)胞P3株，經(jīng)檢測毒力穩(wěn)定，免疫原性好，對現(xiàn)在流行的病毒株都具有良好的保護(hù)作用，建立病毒庫，將5代設(shè)為主種子批，8代設(shè)為工作種子枇；
　　 3．收獲病

4、毒液，在接種病毒后每日觀察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到+++～++++時(shí)收獲病毒液，每日收獲1次，連續(xù)收獲3～5天，合并后加入甲醛滅活。
　　 4．將滅活實(shí)驗(yàn)合格的病毒收獲液超濾濃縮50倍。
　　 5．采用凝膠層析的方法純化疫苗，去除雜蛋白，降低不良反應(yīng)的發(fā)生。
　　 6．將純化后原液稀釋分裝，制各成凍干或者水針。
　　 7．按照藥典的要求對成品進(jìn)行全面檢定。
　　 結(jié)論：
　　 1．使用Ve

5、ro細(xì)胞作為乙腦疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)，細(xì)胞學(xué)穩(wěn)定，沒有外源因子污染和致瘤性的危險(xiǎn)，且培養(yǎng)簡單、使用代次高。
　　 2．選用滅活工藝生產(chǎn)疫苗。采用經(jīng)典的甲醛作為滅活劑滅活乙腦病毒，按照1:2000的濃度加入甲醛，在4℃作用28天，通過細(xì)胞培養(yǎng)．動(dòng)物法進(jìn)行滅活驗(yàn)證。
　　 3．采用Sepharose6FF凝膠過濾層析純化疫苗，其分離條件溫和、重現(xiàn)性好，還具有較高的回收率。
　　 4．采用細(xì)胞蝕斑法代替小鼠法進(jìn)行病毒滴度檢測