需氧菌性陰道炎致病菌和TLR2-4-MyD88及介導(dǎo)細(xì)胞因子在其發(fā)病中作用的研究.pdf

1、需氧菌性陰道炎（aerobic vaginitis，AV）是近年提出的一種陰道炎，致病菌、發(fā)病機(jī)制不清。我們前期研究顯示，AV時(shí)陰道乳桿菌減少而革蘭陽性或陰性需氧菌增多，分泌物白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β/6/8升高，但何種乳桿菌減少、何種需氧菌增多，及細(xì)胞因子變化機(jī)制、與AV發(fā)生關(guān)系不明。感染相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體（Toll like receptors，TLR）2和4可分別識(shí)別革蘭陽性菌肽聚糖和陰性菌脂多糖

2、，激活TLR2/4信號(hào)通路、調(diào)控細(xì)胞因子產(chǎn)生、導(dǎo)致炎癥，其中髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor88，MyD88）是該信號(hào)通路中胞內(nèi)關(guān)鍵接頭分子。陰道上皮有TLR2/4表達(dá)，且AV中需氧菌增加伴細(xì)胞因子改變，這些均提示AV可能是需氧菌激活TLR2/4信號(hào)通路、上調(diào)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)所致。高通量測(cè)序在陰道菌群分析更具優(yōu)勢(shì)，且液相芯片技術(shù)較酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法更便于檢測(cè)多種細(xì)胞因子濃度。因此，本研究分

3、三部分探討AV致病菌、TLR2/4/MyD88分子及其可能調(diào)控細(xì)胞因子的改變?cè)贏V發(fā)生中的作用。
　　一、AV患者較健康女性陰道菌群改變分析
　　目的：應(yīng)用高通量測(cè)序了解健康女性陰道菌群構(gòu)成，分析AV患者陰道菌群改變，以期發(fā)現(xiàn)AV致病是因某些乳桿菌菌種減少、需氧菌增加所致。
　　方法：隨機(jī)選擇2014年12月~2015年12月就診天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科門診AV患者53例作為實(shí)驗(yàn)組，選取同期天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院健康管理中心

4、的健康查體女性53例作為對(duì)照組，收集陰道灌洗液離心沉淀樣本提取總DNA，針對(duì)細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，通過比較兩組在不同分類層級(jí)下物種差異，探討AV患者較健康女性陰道菌群改變。
　　結(jié)果：（1）AV組與對(duì)照組測(cè)序有效序列量分別為3195798個(gè)、3264786個(gè)；共聚類2459個(gè)“操作分類單元”（Operational Taxonomic Units，OTU），AV組（70[39~1514]個(gè)）平均OTU數(shù)顯

5、著高于對(duì)照組（53[37~506]個(gè)，P＜0.001）；兩組在不同分類層級(jí)下物種注釋共發(fā)現(xiàn)25個(gè)門、51個(gè)綱、110個(gè)目、224個(gè)科、483個(gè)屬及719個(gè)種。其中，AV組、對(duì)照組分別注釋有626、516個(gè)菌種。
　?。?） AV組陰道菌群與對(duì)照組相比有顯著差異（ R=0.4571；A=0.1737；P=0.001）。厚壁菌門（乳桿菌屬所在分類上級(jí)）在對(duì)照組占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（97.90％），在AV組平均相對(duì)豐度顯著下降（58.19%，P＜

6、0.001）；而放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭菌門等在AV組較對(duì)照組顯著增加（P＜0.001）。
　　（3）健康女性陰道內(nèi)發(fā)現(xiàn)18個(gè)乳桿菌菌種。其陰道菌群中，卷曲乳桿菌（64.76%）和惰性乳桿菌（29.79%）構(gòu)成94.55%細(xì)菌量，其他平均相對(duì)豐度＞0.1%的13個(gè)菌種依次為陰道加德納菌（1.01%）、德氏乳桿菌（0.99%）、加氏乳桿菌（0.62%）、咽頰炎鏈球菌（0.38%）、尿道氣球菌（0.28%）、無乳鏈球菌（0.2

7、3%）、中間普雷沃菌（0.22%）、陰道阿托波氏菌（0.16%）、纖毛菌（0.16%）、陰道乳桿菌（0.14%）和非解乳糖鏈球菌（0.13%）。
　?。?）AV組發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相同的18個(gè)乳桿菌菌種，但卷曲乳桿菌顯著減少（10.54%，P＜0.001），惰性乳桿菌豐度與對(duì)照組無差別（P=0.191），惰性乳桿菌豐度（30.39%）約為卷曲乳桿菌（10.54%）3倍。患者陰道內(nèi)多種需氧菌及兼性厭氧菌顯著增加，如咽頰炎鏈球菌、無乳鏈球菌

8、、尿道氣球菌、非解乳糖鏈球菌、肺炎克雷伯菌、緩癥鏈球菌、糞腸球菌、孿生菌、表皮葡萄球菌、陰道加德納菌等（P＜0.05），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)部分專性厭氧菌豐度也較對(duì)照組升高，如陰道阿托波氏菌、中間普雷沃菌、普氏厭氧球菌等（P＜0.05）。
　　（5）AV組檢測(cè)到生殖支原體、人型支原體和解脲脲原體陽性者比例分別為32.08%（17/53）、52.83%（28/53）、84.91%（45/53）；對(duì)照組陽性者比例分別為3.77%（2/53）、1

9、8.87%（10/53）、62.26%（33/53）。兩組相比AV患者這三種支原體的攜帶率都更高（?28.116，P=0.017），但兩組支原體在陰道菌群中平均相對(duì)豐度均較低（＜0.1%）。
　　結(jié)論：（1）健康女性陰道菌群分布相對(duì)集中化、個(gè)體差異小，主要以卷曲乳桿菌和惰性乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，此外正常陰道菌群中常見細(xì)菌還包括陰道加德納菌、德氏乳桿菌、加氏乳桿菌、咽頰炎鏈球菌、尿道氣球菌、無乳鏈球菌、中間普雷沃菌、陰道阿托波氏菌、纖毛菌

10、、陰道乳桿菌和非解乳糖鏈球菌等。
　?。?）AV患者陰道內(nèi)卷曲乳桿菌顯著減少，菌群構(gòu)成個(gè)體差異大、菌群多樣性增加，咽頰炎鏈球菌、無乳鏈球菌、尿道氣球菌、非解乳糖鏈球菌、肺炎克雷伯菌、緩癥鏈球菌、糞腸球菌、孿生菌、表皮葡萄球菌、陰道加德納菌等多種需氧菌及兼性厭氧菌豐度增加，提示AV致病與多種菌混合感染有關(guān)而非單一致病菌。AV患者支原體攜帶率較健康女性高，提示支原體可能參與AV發(fā)病。
　　二、TLR2、TLR4、MyD88在AV

11、發(fā)病中的表達(dá)及意義
　　目的：研究陰道黏膜固有免疫識(shí)別系統(tǒng) TLR2/4信號(hào)通路中關(guān)鍵分子 TLR2/4、MyD88 mRNA在AV的表達(dá)情況。
　　方法：選擇2015年8月~2016年1月就診AV患者29例作為實(shí)驗(yàn)組，選取同期健康查體女性30例作為對(duì)照組，收集陰道側(cè)壁上1/3上皮細(xì)胞標(biāo)本，采用real time RT-PCR方法檢測(cè)TLR2/4、MyD88 mRNA在AV組和對(duì)照組間表達(dá)差別，分析MyD88與TLR2/4

12、mRNA表達(dá)相關(guān)性，比較TLR2/4、MyD88 mRNA在輕、中和重度AV組間表達(dá)差異。探討TLR2/4、MyD88分子在AV發(fā)生中的作用。
　　結(jié)果：（1）AV組陰道上皮細(xì)胞標(biāo)本TLR2、TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組（P＜0.001）。（2）MyD88與TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。（3）重度AV組TLR2、TLR4、MyD88 mRNA均比輕度AV組表達(dá)量高（P＜0.05），重

13、度AV組MyD88 mRNA比中度AV組表達(dá)量高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：需氧菌可能激活TLR2/4信號(hào)通路參與AV發(fā)生及疾病嚴(yán)重程度的加重。
　　三、AV患者陰道環(huán)境細(xì)胞因子濃度分析
　　目的：研究AV患者陰道環(huán)境細(xì)胞因子分泌情況，分析TLR2/4/MyD88分子表達(dá)與細(xì)胞因子產(chǎn)生水平相關(guān)性，探討其在AV發(fā)生中的作用。
　　方法：選擇2015年9月~2015年12月就診AV患者19例作為實(shí)驗(yàn)組，選取同期健康

14、查體女性20例作為對(duì)照組，收集陰道灌洗液分離上清，采用液相芯片測(cè)定12種細(xì)胞因子（促炎因子：IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12p70、IL-17、IFN-γ、TNF-α；抑炎因子：IL-4、IL-10、IL-13）濃度，分析AV組較對(duì)照組濃度顯著升高的細(xì)胞因子，比較AV組內(nèi)不同嚴(yán)重程度組間細(xì)胞因子濃度差異，結(jié)合第二部分研究，分析TLR2/4/MyD88 mRNA表達(dá)與細(xì)胞因子濃度相關(guān)性。
　　結(jié)果：（1

15、）AV組較對(duì)照組IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12p70、IL-17、TNF-α濃度顯著升高（P＜0.05）。（2）重度AV組IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α濃度較輕度AV組顯著升高（P＜0.05）。（3）TLR2、TLR4、MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量與陰道微環(huán)境中IL-1β、IL-6、IL-12p70、IL-17濃度呈正相關(guān)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：AV表現(xiàn)為陰道局部免疫失衡狀態(tài)，更多促炎性