中性粒細(xì)胞與再生障礙性貧血免疫抑制治療療效關(guān)系的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 粒細(xì)胞集落刺激因子治療的中性粒細(xì)胞反應(yīng)預(yù)測(cè)重型再生障礙性貧血免疫抑制治療早期療效的研究
　　目的：探討重型/極重型再生障礙性貧血(SAA/VSAA)患者免疫抑制治療(IST)前應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)治療的中性粒細(xì)胞反應(yīng)(ANC反應(yīng))，對(duì)于IST早期療效的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　方法：回顧性分析我中心呢2005年9月至2011年11月間接受一線IST治療，并于IST前

2、接受G-CSF治療的共125例SAA/VSAA患者臨床資料。G-CSF治療第n天內(nèi)最大△ANC≥0.5×109/L定義為G-CSF治療有ANC反應(yīng)，＜0.5×109/L定義為無反應(yīng)。首先分別總結(jié)IST前應(yīng)用G-CSF治療有ANC反應(yīng)組和無ANC反應(yīng)組的IST近期療效，并對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析。進(jìn)而為細(xì)化、優(yōu)化這一預(yù)測(cè)指標(biāo)，分別分析G-CSF治療第5天、7天、10天、13天、14天、16天和21天有無ANC反應(yīng)與IST早期療效的關(guān)系，尋找預(yù)

3、測(cè)IST早期療效的最佳ANC反應(yīng)時(shí)間。進(jìn)而，繪制G-CSF治療后10天內(nèi)ANC增高程度（△ANC）預(yù)測(cè)IST療效的ROC曲線，探索G-CSF治療的ANC反應(yīng)預(yù)測(cè)IST早期療效的最佳△ANC界限值。
　　結(jié)果：IST前接受G-CSF治療，獲得ANC反應(yīng)組IST后3個(gè)月血液學(xué)反應(yīng)（IIR）為49％，6個(gè)月HR為61.2％，均顯著高于無ANC反應(yīng)組（3個(gè)月HR28.9％，P=0.023;6個(gè)月HR40.8％，P=0.026）。G-CSF

4、治療5天，7天內(nèi)ANC反應(yīng)尚不能提示IST后3個(gè)月及6個(gè)月HR，而以G-CSF治療10d內(nèi)△ANC≥0.5×109/L作為ANC反應(yīng)界值預(yù)測(cè)IST后3個(gè)月及6個(gè)月療效最佳，ROC曲線下面積最大，且與更長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用G-CSF治療ANC反應(yīng)來預(yù)測(cè)IST后HR的效能接近。G-CSF治療10d內(nèi)獲得ANC反應(yīng)為IST后3個(gè)月療效的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.004)，但并非IST后6個(gè)月療效的獨(dú)立預(yù)后因素。G-CSF治療ANC反應(yīng)組患者5年總生存率顯著

5、高于無反應(yīng)組[（92.8±4.0）％對(duì)（69.5±6.5）％，P=0.025]。
　　結(jié)論：IST前G-CSF治療的ANC反應(yīng)可提示骨髓殘存造血，是方便、實(shí)用的預(yù)測(cè)IST早期療效及長(zhǎng)期生存的指標(biāo)。
　　第二部分 不同中性粒細(xì)胞閾值的極重型再生障礙性貧血患者接受免疫抑制治療的血液學(xué)反應(yīng)及生存研究
　　目的：分析不同中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(ANC)閾值的極重型再生障礙性貧血(VSAA)患者接受一線免疫抑制治療(IST)的早期血液學(xué)

6、反應(yīng)(HR)和長(zhǎng)期生存情況。
　　方法：回顧性分析我中心2006年1月至2011年10月期間連續(xù)收治的145例接受一線r-ATG聯(lián)合環(huán)孢素IST的VSAA患者臨床資料。評(píng)估不同ANC閾值下VSAA患者的早期死亡、早期HR、長(zhǎng)期生存情況，并以受試者操作特征曲線（ROC曲線）法優(yōu)化ANC預(yù)測(cè)VSAA患者HR的臨界值。并進(jìn)行VSAA患者HR及生存相關(guān)因素分析。
　　結(jié)果：VSAA患者IST后3個(gè)月HR率為35.9％，6個(gè)月HR率為

7、46.9％，5年OS率為75.0±3.7％，均明顯劣于SAA(IST后3個(gè)月HR率為65.5％，P=0.000;6個(gè)月HR率為74.5％，P=0.000;5年OS率為92.5±2.6％, P=0.000)。且VSAA早期死亡率高達(dá)8.3％(SAA患者僅為2.7％，P=0.062)。設(shè)定VSAAIST前ANC閾值分別≤0.15×109/L、≤0.10×109/L和≤0.05×109/L，相應(yīng)群組患者早期死亡率分別為9.2％(12/130)

8、、9.9％(11/111)和13.4％(11/82)，即12例早期死亡的VSAA中有11例(91.7％) IST前ANC≤0.05×109/L; IST后3個(gè)月HR率分別為33.8％(44/130)、27.9％(31/111)和22.0％(18/82);6個(gè)月HR率分別為43.8％(57/130)、39.6％(44/111)和34.1％(28/82);5年OS率分別為73.1±4.0％、70.3±4.4％和62.5±5.4％;5年EFS

9、率分別為48.3±4.5％、45.1±4.8％和42.3±5.5％。以0.05×109/L為ANC界值預(yù)測(cè)VSAA患者IST后6個(gè)月HR和12個(gè)月CR+GPR最佳，預(yù)測(cè)IST后6個(gè)月HR靈敏度為58.8％、特異度為70.1％;預(yù)測(cè)12個(gè)月良好HR靈敏度60.9％、特異度72.4％。ANC≤0.05×109/L的VSAA患者早期死亡率為11/82(13.4％)，占VSAA早期死亡患者的91.7％(11/12); IST后3個(gè)月HR率為18

10、/82(22.0％);6個(gè)月HR率為28/82(34.1％);5年OS率為（62.5±5.4）％;5年EFS率為（42.3±5.5）％。
　　結(jié)論：ANC≤0.05×109/L的VSAA患者接受一線IST早期死亡率高、療效差。
　　第三部分：CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ASXL1基因突變干擾U937人髓系白血病細(xì)胞分化及其機(jī)制研究
　　目的：ASXL1基因突變常見于各髓系腫瘤和骨髓衰竭性疾病的惡性轉(zhuǎn)化，且為發(fā)生白血病轉(zhuǎn)

11、化和不良預(yù)后的相關(guān)因素。本研究旨在探討ASXL1基因突變對(duì)人白血病細(xì)胞功能的影響及其作用的分子生物學(xué)機(jī)制，為ASXL1基因突變?cè)谒柘的[瘤性疾病中的作用提供更多依據(jù)，為個(gè)體化和靶向治療提供更多的線索。
　　方法：應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建ASXL1敲除的U937人白血病細(xì)胞系。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行GFP陽性單個(gè)細(xì)胞分選并擴(kuò)增為單個(gè)細(xì)胞來源的克隆。Sanger測(cè)序檢測(cè)各細(xì)胞系A(chǔ)SX L1基因突變情況，篩選出含ASXL1雜

12、合及純和突變的克隆細(xì)胞系。應(yīng)用瑞士吉姆薩染色分析細(xì)胞形態(tài)，G帶進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析，應(yīng)用5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，研究其對(duì)各細(xì)胞系增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)情況，應(yīng)用PMA誘導(dǎo)細(xì)胞分化并比較ASXL1突變細(xì)胞系與野生型分化情況異同，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等。進(jìn)行RNA測(cè)序篩選在ASXL1突變克隆中差異性表達(dá)的基因，并進(jìn)而進(jìn)行信號(hào)通路分析、基因集分析等，研究ASXL1突變對(duì)下游基因表達(dá)的影響，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR和蛋白印

13、跡法驗(yàn)證差異性表達(dá)基因。
　　結(jié)果：應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合單個(gè)細(xì)胞分選技術(shù)構(gòu)建單個(gè)細(xì)胞來源的人U937細(xì)胞系，共獲得56個(gè)野生型細(xì)胞系（ASXL1基因野生型的U937單個(gè)細(xì)胞來源細(xì)胞系），另外17個(gè)突變型細(xì)胞系（6個(gè)含ASXL1雜合突變和11個(gè)含ASXL1純和突變），突變細(xì)胞系均含有共同的c.594insA(Ser199G1ufsx55)位點(diǎn)突變，此突變基因能夠編輯提前終止編碼的截短蛋白。其中3個(gè)ASXL1雜合

14、突變克?。∕T1，MT2和MT3），3個(gè)ASXL1純和突變克隆(MT11，MT12和MT13)，2個(gè)轉(zhuǎn)染后的ASXL1野生型克隆（WT1和WT2），以及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的親代細(xì)胞系WTblk用于進(jìn)一步細(xì)胞功能及RNA測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。整體來看，各個(gè)單細(xì)胞克隆之間異質(zhì)性較大，但野生組與ASXL1雜合突變組、ASXL1純和突變組，在細(xì)胞增殖，凋亡，細(xì)胞周期分布，5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面并無顯著差異。而ASXL1雜合突變組和ASXL

15、1純和突變組相對(duì)于野生組均表現(xiàn)出對(duì)于PMA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞向吞噬細(xì)胞分化能力顯著降低，表現(xiàn)為PMA誘導(dǎo)分化后96小時(shí)，CD11陽性細(xì)胞比例及CD11中位熒光指數(shù)均顯著低于野生組。RNA測(cè)序及信號(hào)通路和基因集分析顯示，ASXL1雜合及純和突變克隆，髓系分化相關(guān)基因通路整體表達(dá)下降，其中與髓系分化相關(guān)的基因CYBB和CLEC5A表達(dá)水平顯著降低。同時(shí)，與細(xì)胞存活相關(guān)的基因集包括干擾素a反應(yīng)通路、MYC靶基因通路和STAT3靶基因通路等廣泛下調(diào)

16、。此外，染色體核型分析顯示相對(duì)于未經(jīng)轉(zhuǎn)染的親代細(xì)胞系WTblk，轉(zhuǎn)染后的ASXL1野生型克隆并未出現(xiàn)額外的染色體核型異常，而ASXL1突變克隆不同程度得獲得額外染色體異常，在4個(gè)檢測(cè)的ASXL1突變克隆中有3個(gè)獲得11號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失。
　　結(jié)論：ASXL1基因突變通過下調(diào)與髓系分化密切相關(guān)的CYBB和CLEC5A等基因干擾髓系分化。此外，ASXL1突變廣泛干擾與細(xì)胞生存相關(guān)的基因通路，并增加人白血病細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性。我們應(yīng)用C