灰飛虱谷氨酸門控氯離子通道(LsGluCls)的表達(dá)模式和藥理學(xué)特性研究.pdf

1、谷氨酸門控氯離子通道(GluCls)是半胱氨酸環(huán)配體門控離子通道超家族(cys-loopLGIC superfamily)中的一類，對(duì)控制吞咽、運(yùn)動(dòng)、感知和保幼激素的生物合成等可能起關(guān)鍵作用。由于GluCls只存在于無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，因此是很多高選擇性藥劑的作用靶標(biāo)。本論文以灰飛虱作為供試?yán)ハx，研究了GluCls的分子生物學(xué)和藥理學(xué)特征，包括基因序列分析、剪接體表達(dá)模式分析和功能驗(yàn)證等。我們所發(fā)現(xiàn)的LsGluCl基因的新的剪接體豐富了昆蟲

2、GluCls的多樣性，并進(jìn)一步探索了其分子生物學(xué)和藥理特征，本研究可為對(duì)以此為作用靶標(biāo)的新藥劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
　　1、灰飛虱GIuCl基因序列分析
　　采用巢式PCR技術(shù)分別克隆了氟蟲腈敏感和抗性2個(gè)品系及1個(gè)田間種群灰飛虱的GluCl基因，對(duì)三個(gè)品系（種群）的GluCl基因進(jìn)行了多態(tài)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了80個(gè)核苷酸多態(tài)性(SNPs)，共導(dǎo)致了20個(gè)氨基酸變化;進(jìn)一步重點(diǎn)分析這20個(gè)氨基酸變化在三個(gè)品系（種群）中的差異，試

3、圖從多態(tài)性方面討論GluCl基因與藥劑使用和抗性水平的關(guān)系。結(jié)果顯示灰飛虱GluCl基因存在大量的多態(tài)性位點(diǎn)，遺傳背景相同的室內(nèi)敏感和氟蟲腈抗性品系存在7個(gè)氨基酸差異(V68I、I73L、S79A、K80T、D82S、V84I、K85T)，遺傳背景不同的田間種群與室內(nèi)敏感品系也有6個(gè)氨基酸的差異(D63A、P66H、A67T、C226Y、P259L、R352C)，且多態(tài)性位點(diǎn)大部分位于親水的N端胞外區(qū)，但由于替換頻率低，無法說明灰飛虱對(duì)

4、氟蟲腈的抗性是因?yàn)镚luCl基因發(fā)生氨基酸突變引起的。
　　通過基因克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)灰飛虱GluCl轉(zhuǎn)錄本存在兩個(gè)剪接位點(diǎn)、兩種剪接模式。第一個(gè)剪接位點(diǎn)位于LSGluCl的N端，即保守的exon3，在昆蟲基因組中存在外顯子exon3a，exon3b和exon3c，通過互斥外顯子的剪接形式形成了不同剪接體LsGluCl-A、LsGluCl-B和LsGluCl-C;第二個(gè)剪接位點(diǎn)是在第三和第四跨膜區(qū)之間的胞內(nèi)區(qū)域，附加了一段編碼SDDVL

5、FQ的短肽，出現(xiàn)了另一種剪接形式即可變的3'端，形成了兩種不同的GluCl蛋白，即LsGluCL-L和LsGluCl-S。
　　2、灰飛虱GluCl剪接體表達(dá)模式
　　根據(jù)不同剪接體的不同堿基序列設(shè)計(jì)引物，通過熒光定量PCR技術(shù)，得到不同剪接體在灰飛虱不同發(fā)育階段及成蟲不同組織的表達(dá)差異。定量結(jié)果顯示，首先，第一個(gè)剪接位點(diǎn)所形成的三種剪接體在灰飛虱不同發(fā)育階段，LsGluCl-A剪接體一直高水平表達(dá)，LsGluCl-B在各個(gè)

6、階段表達(dá)水平低于A高于C，且表達(dá)水平在不同階段無明顯變化，而LsGluCl-C則隨著蟲齡增大表達(dá)水平隨之上升，在4齡后與B的表達(dá)水平達(dá)到一致;其次，另一個(gè)剪接位點(diǎn)形成的剪接體LsGluCl-L在灰飛虱4齡之前是LsGluCl基因的主要存在形式，而在5齡和雌成蟲期，LsGluCl-S剪接體表達(dá)量顯著增多。GluCls主要存在于昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉神經(jīng)中，所以在頭部和腿部表達(dá)量較高，本論文所得到的結(jié)果也顯示所有剪接體都在成蟲頭部表達(dá)量最

7、高，其中LsGluCl-A的表達(dá)水平顯著高于B和C;LsGluCl-S和LsGluCl-L的表達(dá)水平基本一致。在抗、感品系LsGluCl不同剪接體表達(dá)差異中顯示，氟蟲腈抗性品系中，只有LsGluCl-A剪接體表達(dá)水平明顯下降(p＜0.05），而其他剪接體則沒有明顯變化(p＞0.05)，結(jié)果最終導(dǎo)致總型LsGluCl在氟蟲腈抗性品系中表達(dá)量下降。
　　3、灰飛虱GluCls電藥理學(xué)特性研究
　　在無脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中，抑制性

8、谷氨酸受體（IGluR）與離子通道偶聯(lián)，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸起快速反應(yīng)，從而達(dá)到抑制作用。本論文從灰飛虱體內(nèi)克隆得到了GluClα亞基，采用體外轉(zhuǎn)錄、cRNA注射、爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)和雙電極電壓鉗記錄來研究其功能。對(duì)照結(jié)果顯示L-谷氨酸(濃度為1μM)對(duì)未注射LsGluCl的cRNA的卵母細(xì)胞（同體積的超純水）不能誘發(fā)出可見電流，而記錄的50例注射cRNA的細(xì)胞中，持續(xù)灌流谷氨酸(1μM)，可在95％的細(xì)胞上誘發(fā)出內(nèi)向電流。不同濃度的谷氨酸灌

9、流所誘發(fā)的電流幅度隨谷氨酸濃度的升高而增大，利用origine8.0軟件對(duì)谷氨酸誘發(fā)電流的量效關(guān)系曲線進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果顯示:EC50=18.69±3.5μM。
　　在20μM谷氨酸灌流的基礎(chǔ)之上，測(cè)定拮抗劑氟蟲腈和PTX對(duì)GluCls的抑制作用。其對(duì)爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的LsGluCls通道電流的抑制作用，均具有濃度依賴特性，IC50值分別為396±96nM、67.5±18.5μM，可見氟蟲腈對(duì)GluCls的抑制效率顯著高于PTX。