以TCF為抗癌化合物靶標(biāo)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：以TCF轉(zhuǎn)錄子為靶點(diǎn)篩選具有Wnt通路抑制活性的化合物，并開(kāi)展其作用機(jī)制研究。
　　方法：將TCF轉(zhuǎn)錄子Bindingsite克隆到帶熒光素酶基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到293T工具細(xì)胞中，24h后接種到96孔板中同時(shí)加入10％的Wnt3A細(xì)胞上清液，12h后加入化合物，以DMSO組為空白對(duì)照。藥物作用12h后離心去掉細(xì)胞液，加入熒光素酶裂解液，置于酶標(biāo)儀中讀取數(shù)據(jù)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。將乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB231，白血病細(xì)胞

2、K562、HEL，黑色素瘤細(xì)胞 WM9，胰腺癌細(xì)胞SW480等，接種于96孔板中，每孔約8000個(gè)細(xì)胞，加入活性化合物，72h后離心去掉細(xì)胞液，加入MTT液作用4h，離心去掉MTT液，每孔加入200μlDMSO，水平搖床搖晃至完全溶解，酶標(biāo)儀下490nm處檢測(cè)。將乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞接種于6孔板中，加入具有細(xì)胞毒性化合物作用24h，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，流式細(xì)胞儀下檢測(cè)周期凋亡。將乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB231接種于6孔板中，加

3、入具有細(xì)胞毒性化合物作用24h，提取RNA，照試劑盒說(shuō)明書(shū)PCR儀中檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量，同上所述接種細(xì)胞，加入活性化合物作用12h，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：熒光素酶化合篩選系統(tǒng)篩選了1500余個(gè)化合物，其中2個(gè)化合物A661、A665能夠抑制轉(zhuǎn)錄子TCFBS基因表達(dá)，提示A661、A665能夠抑制Wnt通路；經(jīng)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231，白血病細(xì)胞K5

4、62、HEL，黑色素瘤細(xì)胞WM9及結(jié)腸癌細(xì)胞SW480有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn) A661能夠明顯引起乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231發(fā)生凋亡，A665能夠引起白血病細(xì)胞 K562發(fā)生凋亡，A661及A665能夠引起白血病細(xì)胞HEL發(fā)生凋亡，A661及A665能夠引起乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231 S/G2期阻滯；進(jìn)一步的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)A661及A665能夠在MDA-MB231中抑制Wnt通路靶蛋白β-catenin、cyclin

5、 D1的表達(dá)，抑制Wnt通路靶基因Axin2的mRNA表達(dá)，并激活GSK3蛋白的磷酸化，磷酸化的GSK3能夠降解Wnt通路靶蛋白β-catenin表達(dá)，從而阻滯Wnt通路；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物A661及A665能夠延長(zhǎng)Friend病毒引起的白血病小鼠存活時(shí)間，增加血紅細(xì)胞數(shù)量，改善貧血癥狀；研究還發(fā)現(xiàn)：A661及A665為Fli-1的抑制劑，能夠抑制紅白血病關(guān)鍵調(diào)控因子Fli-1表達(dá)，促進(jìn)Fli-1下游負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。