‘華特’和‘紅陽’獼猴桃果實(shí)發(fā)育中糖代謝特性及其相關(guān)基因表達(dá)分析.pdf

1、獼猴桃風(fēng)味獨(dú)特，口感鮮美，富含維生素C、膳食纖維和多種礦物營養(yǎng)，并具有諸多的保健功效，是當(dāng)今世界備受青睞的重要水果之一。毛花獼猴桃‘華特’（Actinidiaeriantha‘White’）和中華獼猴桃變種紅肉獼猴桃‘紅陽’（Actinidia chinensis var.rufopulpa‘Hongyang’）為我國近年來自主育成的優(yōu)良品種。迄今為止，對于毛花獼猴桃的低糖高酸和中華獼猴桃紅肉變種的高糖低酸的現(xiàn)象，果實(shí)淀粉積累類型，糖積

2、累規(guī)律及動態(tài)變化，糖代謝相關(guān)酶的活性變化和相關(guān)基因的表達(dá)，以及糖代謝與潰瘍病發(fā)生的相關(guān)性等一些最基本、最重要的問題，所知甚少。故通過對比研究其果實(shí)發(fā)育過程中淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖等碳水化合物含量和糖代謝相關(guān)酶活性的變化及其相關(guān)酶基因的克隆與表達(dá)，以及利用分子生物學(xué)快速分離與鑒定潰瘍病病原菌，研究糖代謝與潰瘍病相關(guān)性，探明其糖代謝特性，以期為獼猴桃高糖和優(yōu)質(zhì)育種提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步開展獼猴桃抗細(xì)菌性潰瘍病的研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如

3、下:
　　1.基于BBCH衡量法研究‘華特’果實(shí)發(fā)育特性
　　解析了‘華特’從花后至衰老整個過程的果實(shí)形態(tài)、生長和發(fā)育等特性，以及果實(shí)碳水化合物和有機(jī)酸的積累及其動態(tài)變化，并基于BBCH衡量法，構(gòu)建了一個系統(tǒng)描述‘華特’果實(shí)生長發(fā)育的標(biāo)準(zhǔn)模型。明確了‘華特’獼猴桃果實(shí)發(fā)育亦呈現(xiàn)細(xì)胞分裂、果實(shí)膨大（以淀粉積累為主）和果實(shí)成熟三個重要時(shí)期。細(xì)胞分裂期主要包含70-74階段，果實(shí)膨大期包含74-80階段，果實(shí)成熟期包含80-90階

4、段?！A特’獼猴桃風(fēng)味獨(dú)特，糖組份分配合理，以果糖含量為最高，有機(jī)酸積累時(shí)間較長，蘋果酸含量較高，能在蔓上軟熟。
　　2.‘華特’和‘紅陽’獼猴桃果實(shí)發(fā)育過程中糖代謝特性
　　(1)明確了中華獼猴桃變種‘紅陽’為高淀粉積累型品種，而毛花獼猴桃‘華特’為低淀粉積累型品種。‘紅陽’果實(shí)淀粉積累平均速率為0.685 mg·gFW-1d-1，淀粉積累峰值為70.78 mg·gFW-1，分別是‘華特’的1.34倍和1.69倍，且其淀粉

5、積累時(shí)間比‘華特’長21 d，表現(xiàn)為積累增速快、峰值高和時(shí)間長?！A特’果實(shí)淀粉在采前已急劇下降，至采收時(shí)幾乎均轉(zhuǎn)化為可溶性糖;而‘紅陽’果實(shí)淀粉含量仍直線增長，并在采前維持在一個較高的水平。
　　(2)測定分析了‘華特’和‘紅陽’果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中碳水化合物含量與糖代謝相關(guān)酶活性之間的相關(guān)性，明確了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是影響淀粉積累的關(guān)鍵酶，此外中性轉(zhuǎn)化酶(NI)、酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和蔗糖磷酸合酶(SPS)活性

6、的差異可能也是造成淀粉積累高低、干物質(zhì)多少、可溶性糖組分及含量不同的重要原因。‘紅陽’和‘華特’的淀粉含量與AGPase和SPS酶活性的相關(guān)性最強(qiáng)，而與NI和AI酶活性呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)?！t陽’的AGPase和SPS的活性一直明顯強(qiáng)于‘華特’，而NI和AI酶活性卻始終顯著低于‘華特’。
　　3.獼猴桃果實(shí)糖代謝相關(guān)基因的克隆
　　采用同源克隆、RT-PCR技術(shù)和RACE相結(jié)合的方法，從‘華特’獼猴桃果實(shí)總RNA克隆到6個糖代謝相

7、關(guān)基因的cDNA片段及2個cDNA全長，其中5個在GenBank上登錄?？寺〉恼崽寝D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SUT)基因（AeSUT）、SPS基因（AeSPS）、蔗糖合酶(SuSy)基因（AeSUSY）、AI基因（AeINA）和NI基因（AeINN）的cDNA片段，長度分別為309bp、264 bp、438 bp、744 bp和1725 bp，氨基酸同源序列顯示分別與紫毛蕊花SUT、中華獼猴桃SPS、葡萄SuSy、番茄AI和木薯NI同源性最高，各自達(dá)到

8、80％,98％,82％，81％和83％。獲得了果糖激酶(FK)基因的cDNA片段（AeFK1）、AGpase基因的cDNA全長（AeAGP1）和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因的cDNA全長（AeUGP1），其長度分別為990 bp、1758 bp和1732 bp，各包含一個大小為990 bp、1518 bp和1428 bp的開放閱讀框（ORF），預(yù)測的蛋白分子量分別為35.34 kDa、55.54 kDa和51.84 k

9、Da。AeFK1和AeAGP1氨基酸同源序列分別與中華獼猴桃的FK和AGPase的同源性最高，均達(dá)到99％，AeFK1和AeAGP1各與中華獼猴桃FK基因和AGPase基因親緣關(guān)系最近;AeUGP1氨基酸同源序列與楊樹UGPase同源性最高，達(dá)到92％,與番薯UGPase基因親緣關(guān)系最近。
　　4.獼猴桃實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析最適內(nèi)參基因篩選
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了ACTB、TUB、18SrRNA和GAPDH4

10、個常用植物內(nèi)參基因在‘華特’獼猴桃不同組織及不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)差異情況。經(jīng)GeNorm軟件分析發(fā)現(xiàn)，4種內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性各異，TUB和ACTB在6種不同組織中表達(dá)均穩(wěn)定，而18SrRNA在不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)分析中最穩(wěn)定。
　　5.獼猴桃糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析
　　(1)在‘華特’獼猴桃根、莖、葉、花、果中均有AeAGP1、AeUGP1、AeSPS、AeSUSY、AeINA、AeINN、AeFK1和A

11、eSUT基因的表達(dá)。其中AeAGP1和AeUGP1分別在葉和莖中相對表達(dá)量最高，兩者均在花中表達(dá)量最低;AeINA、AeINN和AeFK1則在根中表達(dá)量最高，花中表達(dá)量最低;AeSPS、AeSUSY和AeSUT均在根中表達(dá)量最低，而分別在花、幼果和莖中表達(dá)量最高。
　　(2)比較分析了‘華特’和‘紅陽’果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中糖代謝關(guān)鍵酶基因的差異表達(dá)。在‘紅陽’果實(shí)各發(fā)育階段的基因表達(dá)量，除AeAGP1基因遠(yuǎn)高于‘華特’果實(shí)相同發(fā)育階段外

12、，其余7個基因表達(dá)量均低于‘華特’果實(shí)相同發(fā)育階段的基因表達(dá)量。除基因AeINN和AeSPS外，其余6個基因表達(dá)量均隨著‘華特’果實(shí)發(fā)育而下降，而AeINN基因表達(dá)量呈先降后升、再降再升的態(tài)勢，AeSPS基因表達(dá)量呈先升后降趨勢，至133 DAA達(dá)其最高轉(zhuǎn)錄水平。AeUGP1、AeINA和AeINN基因表達(dá)量均隨著‘紅陽’果實(shí)發(fā)育而下降，而AeAGP1表達(dá)量在‘紅陽’中表現(xiàn)為先升后降，然后再升再降的態(tài)勢，AeSPS基因表達(dá)量表現(xiàn)為升-降

13、-升的趨勢，AeSUSY、AeFk1和AeSUT基因表達(dá)量均表現(xiàn)為先升后降趨勢，最高轉(zhuǎn)錄水平分別出現(xiàn)在56 DAA、28DAA和84 DAA。
　　(3)CPPU處理能明顯促進(jìn)‘紅陽’果實(shí)發(fā)育過程中AeAGP1、AeUGP1、AeINA和AeSUSY基因的上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量最高相差倍數(shù)分別為6.65倍、3.46倍、6.47倍和9.03倍，且AeSUSY基因表達(dá)高峰比對照提前7d出現(xiàn);CPPU處理調(diào)控AeIN、AeFK1基因在果實(shí)發(fā)育

14、前期下調(diào)表達(dá)，后期上調(diào)表達(dá)，AeSPS基因于細(xì)胞分裂期上調(diào)表達(dá)，果實(shí)膨大和成熟期下調(diào)表達(dá)，AeSUT基因下調(diào)表達(dá)，最高相差4.88倍。
　　6.獼猴挑細(xì)菌性潰瘍病病原菌分子鑒定及糖含量與潰瘍病發(fā)生相關(guān)性
　　對分離得到的6個代表菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，獲得了大小約為280 bp的特異性片段，其測序結(jié)果與登錄號為D86357和AY342165的Pseudomonas syringae pv.Actinidiae的序列完全一致

15、，為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringaepv.Actinidiae）。鑒定了18份種質(zhì)材料的抗性，發(fā)現(xiàn)‘紅陽’等中華獼猴桃最感，‘華特’、‘迷你華特’等毛花獼猴桃高抗，‘海沃德’等美味獼猴桃居中。不同抗性獼猴桃品種接種病原菌后，枝、葉中可溶性糖、淀粉含量均與潰瘍病發(fā)生呈正相關(guān)，系數(shù)分別為0.946、0.896、0.971和0.996;而枝、葉中可溶性蛋白含量與潰瘍病發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，系數(shù)分別為-0.962和