與RBSDV P10互作的灰飛虱蛋白因子篩選及RBSDV P9-1沉默抑制子活性分析.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)第2組的成員，可危害水稻、玉米、小麥、大麥等植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。RBSDV主要通過灰飛虱(Laodelphaxsreiatellus Fallén)進行傳播。RBSDV基因組由10條雙鏈核糖核酸組成，含有13個開放閱讀框(open reading frame

2、，ORF)，編碼13個蛋白。
　　 為獲取灰飛虱傳播RBSDV所需的介體因子，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，選取RBSDV S10編碼的外殼蛋白P10為誘餌，篩選灰飛虱cDNA文庫，以期獲得與RBSDVP10蛋白特異互作的灰飛虱蛋白。首先，利用RT-PCR方法擴增獲取RBSDV外殼蛋白基因P10，并將其構(gòu)建到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7，之后通過順序轉(zhuǎn)化法篩選灰飛虱cDNA文庫。陽性克隆子cDNA插入片段的大小通過PCR進行鑒定，

3、并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α后進行測序，測序序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析。通過篩選共獲得455個陽性克隆，送交公司測序的有377個克隆，經(jīng)分析分別編碼15種不同的互作蛋白，如actin、serpin peptidase inhibitor3、RACK和GAPDH3等。研究結(jié)果為進一步獲取灰飛虱傳播RBSDV的介體因子及揭示介體傳毒機制奠定了基礎。
　　 目前生產(chǎn)上對由RBSDV和南方水稻黑條矮縮病毒(South

4、ern Rice black-streakeddwarf virus，SRBSDV)引起的病害缺乏有效的抗病品種。本文利用重組PCR技術(shù)融合來自RBSDV S6編碼的基因片段S6和SRBSDV S6編碼的基因片段SR6獲得長為600 bp的S6-SR6融合基因片段，RBSDV S10編碼的基因片段S10和SRBSDV S10編碼的基因片段SR10通過重組PCR進行融合獲得長為600bp的S10-SR10融合基因片段。將所得融合基因片段以

5、反向重復的方式連入pBS-intron載體，之后定向插入到植物表達載體pCABIA1301上，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，從而構(gòu)建了同時含有兩種病毒基因的RNAi植物表達載體pCABIA1301-S6-SR6(i/r)和pCABIA1301-SR10-S10(i/r)。酶切和PCR鑒定證明所構(gòu)建的載體與預期的設計一致。該研究結(jié)果為培育具有抗RBSDV和SRBSDV的植物新品系奠定了基礎。
　　 為分析病毒基因編碼的沉默抑制子功能，我們在前期研

6、究的基礎上，對RBSDVS9-1編碼的P9-1蛋白的抑制子活性進行了進一步分析。農(nóng)桿菌共浸潤的方法表明，P9-1能抑制由正義RNA介導的局部沉默，不能抑制由dsRNA引起的局部沉默，不能抑制由GFP引起的系統(tǒng)沉默，但能阻礙沉默信號的傳導。相關研究表明，某些病毒抑制子基因的表達量遠高于其他基因組組分。為了明確P9-1基因在基因組中的相對表達豐度，本研究利用Real-Time PCR技術(shù)分析了P9-1基因相對其他基因組組分的表達豐度。結(jié)果表