Tregs促進(jìn)小鼠矽肺纖維化中Th27分化的調(diào)控機(jī)制及Th17促進(jìn)小鼠矽肺早期炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 矽肺(silicosis)是由于生產(chǎn)過程中長期吸入游離二氧化硅含量較高的粉塵而引起肺組織炎癥和纖維化的職業(yè)性疾病，是主要的塵肺病類型。矽塵導(dǎo)致的肺部炎癥是肺組織纖維化的病理基礎(chǔ)，探討此類炎癥的免疫學(xué)機(jī)制將為矽肺纖維化的預(yù)防和有效控制提供新的理論依據(jù)。
　　 天然免疫（例如巨噬細(xì)胞）及適應(yīng)免疫（例如Th1、Th2淋巴細(xì)胞）在矽塵誘發(fā)的肺部炎癥中均有重要作用。天然免疫過程通常起始于外來物質(zhì)與巨噬細(xì)胞之間的接觸。

2、矽塵可以刺激巨噬細(xì)胞合成細(xì)胞因子前IL-1β，前IL-1β通過NALP3炎癥小體活化并釋放到細(xì)胞外。這一反應(yīng)將啟動(dòng)適應(yīng)免疫進(jìn)程，并伴隨著一系列肺部炎癥，包括:炎癥細(xì)胞浸潤、增殖及胞外基質(zhì)沉積等。
　　 繼Th1細(xì)胞及Th2細(xì)胞后，人們新近發(fā)現(xiàn)了一群新的適應(yīng)免疫細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞。它可以分泌IL-17A（通常被稱為IL-17），IL-17F及IL-22。Th17通過招募中性粒細(xì)胞和其它細(xì)胞因子，在許多肺部的炎癥和疾病中發(fā)揮重要作

3、用。 IL-1β是促Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子之一。RORγt是Th17關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。CD4+CD25+T細(xì)胞，又叫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在免疫穩(wěn)態(tài)及平衡中起到一個(gè)免疫抑制功能的細(xì)胞亞群。有些研究者認(rèn)為Tregs會(huì)抑制Th17細(xì)胞的分化;另一些則認(rèn)為Tregs可以促進(jìn)Th17的分化。
　　 肺部炎癥是許多纖維化型肺部疾病的共同特征，但矽塵誘發(fā)肺部炎癥的深層免疫機(jī)制，尤其是炎癥過程中矽塵誘發(fā)適應(yīng)免疫的發(fā)展進(jìn)程以及天然免疫和適應(yīng)免疫之間的關(guān)

4、系還沒有探明。本研究中，我們首先確立Tregs在矽肺小鼠Th17極化過程中的效應(yīng)及調(diào)控機(jī)制。為探討天然免疫及適應(yīng)免疫間的深層機(jī)制，我們用小鼠矽肺模型驗(yàn)證肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-1β情況;通過應(yīng)用IL-1Ra(anakinra)發(fā)現(xiàn)了IL-1β調(diào)控Th17細(xì)胞分化間的機(jī)制;通過應(yīng)用抗IL-17A單克隆抗體證實(shí)了Th17型反應(yīng)在矽塵誘發(fā)早期肺部炎癥中的促炎作用并探討了其作用的深層機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、建立Treg

5、s消除、IL-17中和及IL-1R阻滯小鼠矽肺模型
　　 C57BL/6小鼠（6-8周，雌性）按體重隨機(jī)分組。Tregs消除矽肺模型組小鼠經(jīng)腹腔注射100μl anti-CD25 mAb，消除小鼠體內(nèi)Tregs;單純矽肺模型組、對(duì)照組C57BL/6小鼠腹腔注射等體積的IgG1同型對(duì)照抗體。IL-17中和矽肺模型組小鼠經(jīng)腹腔注射100μl anti-IL17 mAb，中和小鼠體內(nèi)IL-17;單純矽肺模型組小鼠腹腔注射等體積的IgG

6、1同型對(duì)照抗體。IL-1β受體阻滯模型組小鼠經(jīng)腹腔注射1mgIL-1 Ra(anakinra)，阻滯IL-1β生理功能;單純矽肺模型組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。矽肺模型組和生理鹽水對(duì)照組小鼠分別氣管內(nèi)灌注二氧化硅顆粒懸液(2.5mg/50μl)或等量生理鹽水。將各組C57BL/6小鼠分別于灌注后3，7，28，56天或1，4，11天處死，收集BALF;摘取肺門淋巴結(jié)、脾組織，分別制備單細(xì)胞懸液。摘取肺臟，部分保存于-80℃;部分甲醛固

7、定，用于病理實(shí)驗(yàn)。
　　 二、巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)
　　 離心收集肺泡盥洗液中細(xì)胞，5X105/ml，1ml/孔，24孔板培養(yǎng)，貼壁2小時(shí)分離純化巨噬細(xì)胞。收集貼壁巨噬，5X105/ml，1ml/孔，24孔板培養(yǎng)24小時(shí)。分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，凍存于-80℃，
　　 三、炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
　　 將各組動(dòng)物各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的BALF500rpm，4℃，離心10min，收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，取10μl細(xì)胞懸液

8、置于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)=(四個(gè)大格的細(xì)胞總數(shù)/4)×104。取400μl細(xì)胞懸液，室溫1500rpm離心8min，棄上清，加入200μl小牛血清混勻，推片，室溫晾干，用甲醇固定，37℃溫箱過夜，用Giemsa染液染色，室溫15min;蒸餾水背沖，晾干。油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的數(shù)量。
　　 四、病理切片染色
　　 肺組織常規(guī)石蠟切片(5μm)，進(jìn)行H&E染色，石蠟切片放入烘箱

9、內(nèi)烘烤2小時(shí);然后將肺組織切片置于二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯后再浸泡10 min;梯度濃度酒精浸泡各1 min，脫去二甲苯;流水沖洗5 min;蘇木精染色液浸染10min，自來水沖洗，返藍(lán);2％鹽酸酒精20s至1min;自來水沖洗12到24h;0.5％伊紅染液浸染1至2 min，流水沖洗;梯度濃度酒精脫水;二甲苯透明，中性樹膠封片。觀察小鼠肺組織肺間質(zhì)炎性細(xì)胞侵潤及肉芽腫的形成改變。
　　 五、流式細(xì)胞技術(shù)
　　

10、 取BALF、脾、肺門淋巴結(jié)細(xì)胞各1×106個(gè)，應(yīng)用anti-CD3-Percp，anti-CD4-PE-CY7，anti-CD25-APC熒光抗體，4℃條件下避光孵育30min，3％FBS的PBS清洗細(xì)胞兩次，破膜液孵育細(xì)胞30min，再次清洗細(xì)胞兩次，應(yīng)用anti-Foxp3-FITC熒光抗體孵育細(xì)胞1h，進(jìn)行胞內(nèi)染色。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300μl，混勻，F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Diva軟件進(jìn)行分析。

11、>　　 取脾、肺門淋巴結(jié)細(xì)胞各1×106個(gè)，3％FBS的PBS清洗細(xì)胞兩次，固定液固定30min，破膜液清洗一次，破膜液孵育細(xì)胞30min，再次清洗細(xì)胞兩次，應(yīng)用anti-IFN-γ-Alexa Fluor488, anti-CD4-PerCP-Cy5.5,anti-IL-17A-PE, anti-Foxp3-Alexa Fluor647熒光抗體，室溫條件下避光孵育30min。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300μl，混勻，F(xiàn)ACS

12、CantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Diva軟件進(jìn)行分析。
　　 六、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime PCR)
　　 取100mg肺組織，加入1ml Trizol試劑，冰浴勻漿，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新管中，室溫靜置5 min;每管加入200μl氯仿，用力震蕩30秒，室溫靜置3min;4℃，12000rpm，離心15 min;吸取上清至新的1.5ml EP管。加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻后室溫

13、沉淀10 min;4℃，12000rpm離心10 min后，棄上清;加入4℃預(yù)冷的75％乙醇1ml，洗滌沉淀及離心管壁;4℃，7500rpm離心5 min，棄上清;室溫干燥15分鐘;加入30μl RNase-free水，至完全溶解，測(cè)定RNA濃度。應(yīng)用Takara公司逆轉(zhuǎn)錄酶，將2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用ABI7500 Realtime PCR儀定量測(cè)定，相對(duì)定量法計(jì)算基因的表達(dá)水平。
　　 七、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELI

14、SA)
　　 應(yīng)用eBioscience公司的試劑盒檢測(cè)，用100-μl包被抗體孵育96孔板，4℃過夜，洗板，200μl檢測(cè)稀釋液室溫阻斷1h，洗板，加入100μl不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品或樣品室溫孵育2h，洗板，加入檢測(cè)抗體100μl室溫1h，洗板，加入辣根過氧化物酶100μl室溫30min，加入底物室溫孵育15min，加入終止液，450nm處讀板，檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌水平。
　　 八、免疫熒光檢測(cè)
　　 肺組織切片用0.

15、1M PBS清洗兩次，用羊血清(Histostain-Plus Kits，ZSBG-BIO)孵育30min以降低非特異性結(jié)合。用anti-CD4-PE-CY7染料(BD Pharmingen，SanJose，CA，USA)4℃孵育切片過夜。PBS洗三次，用anti-IL17A-AF488染料(eBioscience，San Diego，CA92121，USA)室溫孵育2h，共聚焦激光掃描顯微鏡(TCS sp2/AOBS，LEICA)觀察

16、切片，拍攝圖片，Leica共聚焦軟件分析切片中表達(dá)CD4+IL-17A+細(xì)胞。
　　 九、免疫組化檢測(cè)
　　 肺組織切片用0.1M PBS清洗兩次，1％ H2O2室溫10孵育分鐘。0.1M PBS清洗兩次，用羊血清(Histostain-Plus Kits，ZSBG-BIO)孵育30min以降低非特異性結(jié)合。用anti-TGF-β1 sc-146和anti-IL-1β sc-7884(SANTA CRUZ BIO，Uni

17、tedStates)室溫孵育1h。PBS洗三次，二抗孵育30min(Histostain-Plus Kits9001，ZSBG-BIO)，正置顯微鏡(Eclipse80i，Nikon)觀察切片，拍攝圖片，NIS軟件包分析切片中蛋白陽性表達(dá)。
　　 十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為mean(±)S.E.M，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，用SN

18、K法進(jìn)行組間比較，相關(guān)性用Pearson's correlation coefficients法檢驗(yàn)。p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、Tregs抑制小鼠矽肺模型中性粒細(xì)胞型炎癥
　　 Tregs消除矽肺組小鼠腹腔注射抗CD25單克隆抗體，單純矽肺模型組及生理鹽水對(duì)照組小鼠腹腔注射抗IgG1同型對(duì)照抗體。氣管內(nèi)分別灌注二氧化硅顆粒懸液或生理鹽水。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，抗CD25單克隆抗體有效消

19、除矽肺小鼠脾、淋巴結(jié)及肺泡盥洗液細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs。Tregs消除組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能性表型Foxp3和CTLA-4占CD4+CD25+細(xì)胞比例較矽肺模型組、生理鹽水對(duì)照組小鼠顯著降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腹腔注射CD25抗體從表型和功能上均有效的消除了小鼠體內(nèi)Tregs。Tregs消除小鼠矽肺模型中支氣管周圍肺部炎癥明顯增加。肺泡盥洗液中炎性細(xì)胞尤其中性粒細(xì)胞增加。Tregs消除增強(qiáng)了矽塵誘發(fā)肺部早期中性粒細(xì)胞型炎癥。

20、
　　 二、Tregs促進(jìn)小鼠矽肺模型中Th17型反應(yīng)
　　 Tregs消除明顯降低了7天、28天小鼠矽肺模型中Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγt肺部mRNA的表達(dá)。Tregs消除組IL-17的mRNA水平較單純矽肺模型組從3天開始顯著降低。Tregs消除抑制了矽肺模型中的Th17型反應(yīng)。免疫熒光結(jié)果顯示，一些CD4+（紅色）的T細(xì)胞表達(dá)IL-17A（綠色）;且不是所有的表達(dá)IL-17A的細(xì)胞都是CD4陽性的。矽肺模型組中CD4

21、陽性IL-17A陽性的細(xì)胞(Th17)較生理鹽水對(duì)照組7天時(shí)明顯增加;Tregs消除組和生理鹽水對(duì)照組比較3天河7天都沒有明顯區(qū)別。在Tregs消除組中7天CD4陽性IL-17A陽性細(xì)胞比單純矽肺模型組中低，但是3天是沒有明顯區(qū)別。
　　 三、Tregs通過調(diào)控TGF-β1和IL-1β促進(jìn)Th17細(xì)胞分化
　　 矽肺小鼠肺部IL-10mRNA表達(dá)增加，Tregs消除降低了矽塵誘導(dǎo)IL-10表達(dá)增加的這種趨勢(shì)。Tregs消

22、除組TGF-β1 mRNA水平較矽肺模型組降低顯著。Tregs消除組TGF-β1蛋白水平較矽肺模型組也明顯降低。ELISA檢測(cè)肺泡盥洗液中IL-10和TGF-β1的蛋白水平，結(jié)果顯示了相同的趨勢(shì)。Tregs消除組IL-1β mRNA水平較矽肺模型組明顯降低。IL-1β的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示Tregs消除組IL-1β蛋白水平較矽肺模型組降低。Tregs消除降低了矽肺小鼠中IL-1β的水平。以上結(jié)果提示TGF-β1和IL-1β可能在Th

23、17的分化過程中起作用。
　　 雖然Tregs消除組IL-6mRNA表達(dá)增加，但Th17的分化仍被抑制。Tregs消除組的IL-23水平較矽肺模型組沒有明顯的改變。因此，在小鼠矽肺模型中，Tregs可能不通過IL-6和IL-23來影響Th17分化。
　　 Tregs消除組3天時(shí)間點(diǎn)IL-2表達(dá)水平較矽肺模型組和生理鹽水對(duì)照組增加顯著。Tregs消除組和矽肺模型組IFN-γ較生理鹽水對(duì)照組增加，但只有Tregs消除組有統(tǒng)計(jì)

24、學(xué)意義。Tregs消除組和矽肺模型組IL-12mRNA水平3天明顯增加。Tregs消除組IL-4mRNA水平明顯降低。增強(qiáng)的Th1型反應(yīng)可能抑制了Th17分化和IL-17分泌。
　　 四、矽塵誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)及小鼠Th17、Th1型反應(yīng)矽塵處理1天后小鼠肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的IL-1β mRNA水平明顯增加。矽肺模型組較生理鹽水對(duì)照組小鼠的肺泡巨噬細(xì)胞分泌更多的IL-1β。矽肺模型小鼠脾及肺門淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞的百分

25、比較生理鹽水對(duì)照組1天和4天明顯增加，尤其1天最為顯著。流式結(jié)果顯示，矽塵暴露后Th17細(xì)胞分化情況在起始時(shí)最高然后逐漸降低。矽塵暴露后巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β和脾中Th17細(xì)胞比例之間相關(guān)性顯著。矽肺暴露小鼠脾中和淋巴結(jié)中Th1型細(xì)胞的百分比也明顯增加。但是Th1細(xì)胞比例和巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β間的相關(guān)性不顯著。這些結(jié)果提示小鼠模型中Th17細(xì)胞的分化與肺泡巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β相關(guān)。
　　 五、IL-1β通過誘導(dǎo)Th17

26、分化啟動(dòng)適應(yīng)性免疫
　　 1天、11天受體阻滯矽肺組較矽肺模型對(duì)照組IL-1β水平升高顯著，意味著阻滯劑(anakinra)有效阻滯了IL-1β與IL-1受體結(jié)合。Anakinra明顯降低了脾中和淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞的百分比。阻滯劑組IL-17和RORγ-t的mRNA表達(dá)也明顯降低。阻滯劑組肺組織中IL-17蛋白水平也明顯降低。這些結(jié)果提示IL-1β可以通過IL-1RI調(diào)控Th17細(xì)胞的分化。Anakinra對(duì)Th1分化沒有太大

27、的影響。
　　 病理結(jié)果顯示受體阻滯矽肺小鼠較矽肺模型對(duì)照組的肺部炎癥降低。阻滯劑組肺泡盥沈液中總細(xì)胞和中性粒細(xì)胞1天4天均顯著降低。Anakinra也降低了盥洗液中淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集。肺泡盥洗液炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果也證實(shí)了阻滯劑減輕了矽塵誘發(fā)的肺部炎癥。
　　 六、Th17介導(dǎo)矽肺早期肺部炎癥
　　 肺組織勻漿ELISA結(jié)果顯示，抗IL-17A單克隆抗體有效的中和了肺組織中IL-17A。矽肺抗體組脾中Th

28、17細(xì)胞較同型對(duì)照矽肺模型組降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？笽L-17A單克隆抗體也明顯降低了矽塵誘發(fā)的肺部炎癥。肺泡盥洗液炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果顯示IL-17A中和降低了總細(xì)胞數(shù)。1天和4天矽肺抗體組肺泡盥洗液中中性粒細(xì)胞較矽肺同型對(duì)照組降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也有不同程度降低。這些結(jié)果說明Th17型反應(yīng)在矽肺早期肺部炎癥中起了重要的作用。
　　 七、Th17通過影響Th1和Tregs調(diào)控矽肺Th免疫應(yīng)答
　　 IL

29、-17A中和增加了矽肺模型早期Th1型轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)。IL-17A中和組脾組織中CD4+IFN-γ+ Th1型細(xì)胞較同型對(duì)照抗體組增加，11天有顯著意義。IL-17A中和組淋巴結(jié)中CD4+IFN-γ+ Th1細(xì)胞較同型對(duì)照抗體組也增加。
　　 IL-17A中和增加了矽肺小鼠脾中Tregs轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)。流式結(jié)果顯示IL-17A中和組脾和淋巴結(jié)中Tregs表達(dá)均升高。IL-17A中和組中升高的Tregs可能降低

30、了矽塵誘發(fā)的肺部炎癥。
　　 八、Th17通過IL-22和IL-1β調(diào)節(jié)矽肺早期炎癥
　　 IL-17A中和矽肺模型小鼠脾中IL-22mRNA表達(dá)升高且較矽肺模型對(duì)照組有顯著意義。IL-17A中和矽肺模型組肺組織中IL-22mRNA表達(dá)也升高且較矽肺模型對(duì)照組有顯著意義。IL-17A中和將增加小鼠矽肺模型中IL-22的表達(dá)。IL-17A中和后，小鼠矽肺模型脾中IL-1β mRNA表達(dá)降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-17A中和同