缺氧對HUVECS生物學特性及VEGFR表達影響的體外實驗研究.pdf

1、目的:缺氧(Hypoxia)被認為是血管形成的關鍵因素,因為缺氧條件下可引起血管形成的關鍵因子血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)形成。VEGF可以促進內皮細胞的增殖和遷移、增加血管通透性,因此被確認為是血管生成的主要原因;而血管內皮生長因子刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和管型的形成是通過與其相對應特異性血管內皮生長因子受體(Vascular endothelial Growt

2、h Factor Receptor,VEGFR)結合產生效應。缺氧對血管內皮細胞功能及生長因子的作用仍不明確,所以本實驗嘗試研究在缺氧條件下對培養(yǎng)的臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)血管內皮生長因子以及膜表面受體表達的變化及其缺氧條件下對HUVEC生物學功能的影響。
　　方法:本實驗以購買HUVEC細胞株為究對象,HUVEC細胞傳代培養(yǎng)至第三代或第四代備用。

3、分別在缺氧與常氧條件下培臍靜脈內皮細胞,比較兩種狀態(tài)下 HUVEC增殖、遷移以及體外管腔能力;免疫熒光染色比較 VEGFR1、VEGFR2蛋白的表達變化;RT–PCR檢測兩種條件下VEGF mRNA表達水平的改變。以上原始實驗數據使用SPSS13.0軟件分析數據,數據用均數±標準差(x±s)表示,兩樣本均數比較使用獨立樣本t檢驗;多個樣本兩兩比較先使用方差分析(ANOVA),然后使用多樣本兩兩比較中的SNK法進行比較,以 P<0.05表

4、示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1、缺氧組與常氧組在24h、48h時無明顯差異性(P>0.05);在96h,缺氧組和常氧組比較,細胞的增殖差異明顯(P<0.01),缺氧組的細胞增殖受到抑制。2、細胞遷移分析實驗中,常氧組與缺氧組在48小時的后細胞遷移面積分析結果顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),常氧組的細胞的遷移能力明顯強于實驗組。3、常氧組在48小時后即能夠形成毛細血管腔樣結構,但缺氧組在48小時仍未形成管腔樣結構。4、在

5、缺氧組和常氧組HUVEC培養(yǎng)48h后使用免疫熒光技術檢測VEGFR1、VEGFR2,通過檢測其光密度值檢測其蛋白的表達量,其結果顯示實缺氧組和常氧組比較VEGFR1、VEGFR2蛋白表達量均有明顯下降( P<0.01),但VEGFR1/VEGFR2值增大(P<0.01)。5、實驗組在0h、12h、24h、48h四個時相點分別提取RNA,RT–PCR檢測VEGF mRNA表達量, VEGF表達量在0h和12h時相點無明顯差異(P>0.05

6、),在24h的時相點VEGF表達量開始增加(P<0.05),但24h和48h時相點表達量明顯差異(P>0.05)。
　　結論:HUVEC在缺氧的作用下表現出了細胞增殖、遷移、體外管腔形成能力的減低;VEGFR1、VEGFR2蛋白同時減少的但同時其比值大幅增加,且VEGF mRNA表達增加。其結果表明缺氧時阻斷VEGF與VEGFR2結合產生的對內皮細胞刺激反應,保持內皮細胞相對的穩(wěn)定狀態(tài),以最大限度地保留血管內皮細胞活力和恢復能力,