miR-30b調(diào)節(jié)自噬在肝缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、目的：肝臟缺血再灌注損傷（IRI）是肝移植與肝外科工作中常見的組織器官損傷。肝臟IRI對肝病的發(fā)展、肝臟手術(shù)效果和患者生存預(yù)后至關(guān)重要。如何保護缺血的肝細(xì)胞，減少肝臟IRI的發(fā)生，都是研究的熱點。本研究旨在研究小鼠肝臟IRI傷過程中，miR-30b表達與細(xì)胞自噬活性的變化，探討miR-30b調(diào)節(jié)Atg12對IR處理誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞自噬與損傷的影響，以揭示肝臟缺血再灌注損傷過程中的潛在機制，為肝臟IRI的預(yù)防和治療提供新思路。
　　方法

2、：建立小鼠70％肝臟缺血再灌注模型，檢測小鼠血清ALT、AST含量變化， HE染色與TUNEL法觀察肝臟組織病理學(xué)改變與細(xì)胞凋亡情況；qRT-PCR檢測各組肝組織miR-30b-5p、Atg12 mRNA、Atg5 mRNA的表達變化，透射電鏡觀察肝細(xì)胞自噬體變化與Western blot檢測各組肝組織Atg12、Atg12-Atg5、LC3與Cleave Caspase-3表達變化。小鼠尾靜脈注射miR-30b-5p agomir或m

3、iR-30b-5p antagomir，進一步驗證miR-30b在肝臟發(fā)生缺血再灌損傷過程中的作用。使用自噬激活劑雷帕霉素與自噬抑制劑3-MA預(yù)處理肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞，再建立缺氧/復(fù)氧（H/R）細(xì)胞模型以模擬肝臟IRI，以明確自噬對H/R處理誘導(dǎo)AML12細(xì)胞存活能力的影響。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)（miRBase、TargetScan）、qRT-PCR、Western blot以及Luciferase熒光霉素報告等實驗方法驗證Atg12

4、為miR-30b靶基因。通過miR-30b-5p mimics、miR-30b-5p inhibitor或Atg12 siRNA轉(zhuǎn)染AML12細(xì)胞，共聚焦顯微鏡與透射電鏡觀察AML12細(xì)胞內(nèi)自噬體變化， Western blot檢測各組肝組織自噬蛋白Atg12、Atg12-Atg5、LC3表達變化，以探討miR-30b調(diào)節(jié)Atg12對H/R處理誘導(dǎo)AML12細(xì)胞自噬的影響。
　　結(jié)果：IR處理組小鼠血清ALT、AST含量較Sham

5、組明顯上升（P<0.05），且在肝組織中可觀察到肝細(xì)胞發(fā)生水腫、氣球樣變，肝竇區(qū)變窄、中央靜脈充血和點灶狀壞死等病理變化。缺血再灌注組小鼠肝組織 miR-30b-5p表達水平比Sham降低（P<0.001），并隨著肝臟恢復(fù)血流后時間增加而減少，而Atg12 mRNA、Atg5 mRNA表達水平在各個再灌注時間點均比Sham組增高（P<0.001），并隨著再灌注時間增加而增加；Sham組肝組織內(nèi) TUNEL標(biāo)記的凋亡細(xì)胞較少，而IR處理組

6、凋亡細(xì)胞隨著再灌注時間的增長而顯著增多。透射電鏡下Sham組肝細(xì)胞內(nèi)自噬體較少，而IR處理組的自噬體的數(shù)量亦顯著增多。缺血再灌注組小鼠肝組織自噬標(biāo)記物Atg12、Atg12-Atg5、LC3Ⅱ蛋白表達水平隨著缺血再灌注時間點增加而升高（P<0.05），同時，Cleave Caspase-3蛋白水平隨著缺血再灌注時間點增加而升高。尾靜脈注射miR-30b-5p agomir后小鼠血清ALT、AST水平均降低，而miR-30b-5p ant

7、agomir組小鼠血清ALT、AST水平均升高，各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。miR-30b-5p agomir組肝組織病理學(xué)改變較miR-NC組減輕，TUNEL標(biāo)記的凋亡細(xì)胞數(shù)量減少；而miR-30b-5p antagomir組肝組織病理學(xué)改變加重， TUNEL標(biāo)記的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。與miR-NC組比較，miR-30b-5p agomir組小鼠肝組織中PCNA表達增加，Caspase-3、Cleave Caspase

8、-3、PARP-1蛋白水平降低；而miR-30b-5pantagomir組小鼠肝組織中PCNA表達減少，Caspase-3、Cleave Caspase-3與PARP-1水平較miR-NC組升高。Luciferase熒光霉素報告等實驗方法驗證miR-30b通過結(jié)合Atg12基因的3’-UTR區(qū)抑制Atg12的表達，Atg12是miR-30b的直接靶基因。共聚焦顯微鏡與透射電鏡結(jié)果說明 miR-30b可以減少肝細(xì)胞自噬體形成，抑制細(xì)胞自噬

9、活性。MTT結(jié)果顯示，經(jīng)自噬激活劑雷帕霉素預(yù)處理后，缺氧/復(fù)氧使Rap組AML12細(xì)胞的存活率較IR組顯著降低（P<0.001）；而預(yù)先采用3-MA抑制肝細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平，缺氧/復(fù)氧使3-MA組AML12細(xì)胞的存活率較缺氧/復(fù)氧組顯著上升（P<0.01）；AML12細(xì)胞在H/R處理過程中，miR-30b可增加肝細(xì)胞的存活率，同時Atg12 siRNA均可以提高miR-30b-5p mimics或miR-30b-5p inhibitor

10、預(yù)處理肝細(xì)胞的存活率；Atg12 siRNA均可以降低miR-30b-5p mimics或miR-30b-5p inhibitor轉(zhuǎn)染AML12細(xì)胞后的Atg12、Atg12-Atg5與LC3蛋白表達水平。
　　結(jié)論：缺血再灌注誘導(dǎo)小鼠肝臟組織miR-30b表達下調(diào)，而自噬相關(guān)蛋白Atg12的表達上調(diào)和自噬活性增高。miR-30b可減輕小鼠肝臟IRI，同時抑制肝細(xì)胞凋亡和促進肝細(xì)胞的損傷修復(fù)。肝細(xì)胞IRI過程中，miR-30b通過