腎絡(luò)安方防治早期糖尿病腎病實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、糖尿病腎病是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的第二位病因。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)糖尿病腎病的治療主要是對(duì)癥治療，副作用比較大，患者依從性比較差。晚期行血液透析或腎臟移植術(shù)，腎源缺乏，價(jià)格昂貴，患者難以接受。中醫(yī)藥在治療糖尿病腎病方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，顯示出較大的潛力及廣闊的應(yīng)用前景。腎絡(luò)安方是全國(guó)名老中醫(yī)萬(wàn)政主任中醫(yī)師臨床經(jīng)驗(yàn)方，在治療糖尿病腎病方面取得了良好的療效，為進(jìn)一步驗(yàn)證該方的治療作用，探討其作用機(jī)制，開(kāi)展此

2、項(xiàng)研究。
　　本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方式，建立糖尿病腎病動(dòng)物模型，給予腎絡(luò)安方及厄貝沙坦干預(yù)治療，觀察PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路下足細(xì)胞Integrinβ1的表達(dá)，觀察高糖條件下對(duì)足細(xì)胞增殖的影響及腎絡(luò)安方的干預(yù)作用，并開(kāi)展腎絡(luò)安方的臨床實(shí)驗(yàn)研究，為糖尿病腎病的中藥治療提供動(dòng)物、細(xì)胞及臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　第一部分腎絡(luò)安方對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)的影響
　　目的：建立糖尿病腎病動(dòng)物模

3、型，觀察大鼠一般情況，腎臟病理形態(tài)，腎功能、血糖、血脂及纖維化指標(biāo)的改變，以驗(yàn)證腎絡(luò)安方對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用。
　　方法：雄性SD大鼠90只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，檢測(cè)血糖及尿蛋白，均為陰性者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取對(duì)照組10只，給予普通飼料喂養(yǎng)。其余80只大鼠為造模組，給予高脂飼料飼養(yǎng)。造模組大鼠飼養(yǎng)12周后一次性腹腔注射STZ35mg·kg-1，對(duì)照組給予注射相應(yīng)體積0.1mol·L-1枸櫞酸緩沖液。72h后造模組大鼠行尾靜脈

4、采血，以三次尾靜脈空腹測(cè)血糖值均≥16.7 mmol/L為糖尿病造模初步成功。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組19只、厄貝沙坦組19只、中藥組19只和中藥聯(lián)合厄貝沙坦組20只。造模成功一周后開(kāi)始給藥。厄貝沙坦組大鼠給予厄貝沙坦15.75 mg·kg-1·d-1灌胃。中藥組給予10.44g·kg-1·d-1灌胃，聯(lián)合組按上述中藥組及厄貝沙坦組的給藥方法聯(lián)合應(yīng)用。對(duì)照組及模型組給予等劑量生理鹽水灌胃。灌胃開(kāi)始之日起記為第1天。每日一次，連續(xù)灌胃

5、16周。觀察大鼠一般狀況、腎臟相關(guān)指標(biāo)、病理組織形態(tài)學(xué)變化、腎小球基底膜形態(tài)學(xué)變化的影響等。
　　結(jié)果：
　　1實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況
　　共70只大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，其中對(duì)照組10只，模型組14只，厄貝沙坦組15只，中藥組15只，聯(lián)合組16只。
　　2各組大鼠雙腎重量/體重（KI）的比較
　　與對(duì)照組相比，模型組及各治療組 KI明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組KI降低（P<0.05）。各治療組

6、間比較，KI無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　3各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)空腹血糖（FBG）的比較
　　與對(duì)照組相比，模型組及各治療組 FBG在不同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，中藥組、聯(lián)合組均在12w、16w FBG明顯降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組在16w FBG明顯降低（P<0.05）。
　　4各組大鼠糖化血紅蛋白（HbA1c）的比較
　　與對(duì)照組相比，模型組及各治療組HbA1c

7、明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，中藥組、聯(lián)合組 HbA1c值明顯降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組 HbA1c值明顯降低（P<0.05）。與中藥組相比，聯(lián)合組HbA1c值明顯降低（P<0.05）。
　　5各組大鼠穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法測(cè)定胰島素抵抗指數(shù)（Homa-IR）的比較
　　16w Homa-IR水平比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組Homa-IR明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組Homa-

8、IR降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組Homa-IR明顯降低（P<0.05）。與中藥組相比，聯(lián)合組Homa-IR值降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　6各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24h尿蛋白定量情況的比較
　　對(duì)照組24h尿蛋白定量最低，并保持穩(wěn)定（P<0.05）。與對(duì)照組相比，模型組及各治療組在4w、8w、12w、16w24h尿蛋白定量均增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。模型組尿蛋白定量在不同時(shí)間點(diǎn)逐步增高。

9、與模型組相比，各治療組在8w、12w、16w檢測(cè)尿蛋白定量明顯減低（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組在16w檢測(cè)顯示尿蛋白定量明顯降低（P<0.05）。
　　7各組大鼠腎功能的比較
　　UA水平比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組UA均有不同程度增高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組UA均有降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組UA降低更明顯（P<0.05）。
　　Scr水平比較：與對(duì)照組相比，模

10、型組及各治療組Scr增高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組Scr降低（P<0.05）。各治療組之間Scr比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　BUN水平比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組 BUN明顯升高（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組BUN降低明顯（P<0.05）。與中藥組相比，聯(lián)合組BUN明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　8各組大鼠TP、ALB的比較
　　TP比較：與對(duì)照組相比，模型

11、組及各治療組 TP水平明顯降低（P<0.05）。與模型組相比，各治療組TP水平升高（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組TP升高（P<0.05）。與中藥組相比，聯(lián)合組TP升高明顯（P<0.05）。
　　ALB比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組 ALB水平明顯降低（P<0.05）。與模型組相比，各治療組ALB水平升高（P<0.05）。與中藥組相比，聯(lián)合組ALB升高明顯（P<0.05）。
　　9各組大鼠血脂的比較
　

12、　TC比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組TC水平升高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組 TC水平降低（P<0.05）。各治療組之間 TC水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　TG比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組TG水平升高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組TG水平降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組TG明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　HDL比較：各組HDL相比，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

13、P>0.05）。
　　VLDL比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組 VLDL水平明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組 VLDL水平降低（P<0.05）。各治療組之間VLDL水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　10各組大鼠纖維化水平比較
　　LN比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組LN水平升高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組LN水平降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組LN降低明顯（P<0

14、.05）。與中藥組相比，聯(lián)合組LN降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　IV-C比較：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組 IV-C水平升高（P<0.05）。與模型組相比，各治療組IV-C水平降低（P<0.05）。各治療組之間IV-C水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　11光鏡結(jié)果
　　對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠腎小球體積肥大，腎小囊腔狹窄呈裂隙狀，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬，腎小

15、球上皮細(xì)胞排列紊亂，肥大，部分上皮細(xì)胞空泡樣變。與模型組相比，厄貝沙坦組、中藥組、聯(lián)合組腎臟病變均有改善。而尤以聯(lián)合組改善更明顯。
　　12電鏡結(jié)果
　　對(duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。模型組腎小球毛細(xì)血管基底膜勻質(zhì)性增厚，結(jié)構(gòu)欠清晰，系膜基質(zhì)增多，足突增寬或廣泛融合。厄貝沙坦組、中藥組、聯(lián)合組腎小球毛細(xì)血管基底膜節(jié)段性增厚，足突節(jié)段性融合。而聯(lián)合組的病理改善明顯。
　　第二部分腎絡(luò)安方通過(guò) PI3K/Akt/mTOR通路

16、上調(diào)糖尿病腎病大鼠Integrinβ1表達(dá)
　　目的：建立糖尿病腎病大鼠模型，觀察腎臟PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)及足細(xì)胞Intgrinβ1的表達(dá)，以驗(yàn)證PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是否參與糖尿病腎病足細(xì)胞損傷，以及腎絡(luò)安方及厄貝沙坦對(duì)糖尿病腎病腎臟的保護(hù)作用的具體機(jī)制。
　　方法：同上方法復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) Integrinβ1、PTEN、p-Akt、p-mTOR在腎

17、臟組織定位表達(dá)，采用Western blot方法檢測(cè)Integrinβ1、PTEN、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR在蛋白水平的表達(dá)，采用real-time RT PCR檢測(cè)Integrinβ1、PTEN、IV-C在轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1腎組織中Integrinβ1蛋白及mRNA表達(dá)的比較
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組Integrinβ1在腎小球中表達(dá)明顯減少，腎小管染色減輕，而各

18、治療組較模型組表達(dá)增強(qiáng)，尤以聯(lián)合組改善明顯，稍強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　Western blot及Real-time RT-PCR結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組及各治療組的Integrinβ1蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯減低（P<0.05）；與模型組相比，各治療組Integrinβ1蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），尤以聯(lián)合組表達(dá)升高更明顯（P<0.05）。
　　2腎組織中PTEN蛋白及mRNA表達(dá)的比較
　　免疫組織

19、化學(xué)結(jié)果：PTEN在對(duì)照組大鼠細(xì)胞漿中普遍表達(dá)，在細(xì)胞核中少量表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組 PTEN少量陽(yáng)性表達(dá)。而各治療組表達(dá)較模型組增強(qiáng)，尤而聯(lián)合組強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　Western blot及Real-time RT-PCR結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組及各治療組PTEN蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），以模型組表達(dá)最低（P<0.05）；與模型組相比，各治療組PTEN蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯增高（P<0.05），尤

20、以聯(lián)合組升高更明顯（P<0.05）。
　　3腎組織中Akt蛋白表達(dá)的比較
　　Western blot結(jié)果：各組Akt蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　4腎組織中p-Akt蛋白表達(dá)的比較
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果：p-Akt主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿與胞核中。以細(xì)胞胞漿及胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。對(duì)照組腎小球內(nèi) p-Akt表達(dá)較少，而模型組及各治療組腎小球內(nèi)p-Akt表達(dá)增強(qiáng)。與模型組相比，各治療組腎小球內(nèi)p

21、-Akt表達(dá)減弱，尤以聯(lián)合組p-Akt表達(dá)減弱更明顯。
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組p-Akt/Akt升高（ P<0.05）。與模型組相比，各治療組 p-Akt/Akt降低（P<0.05），尤以聯(lián)合組p-Akt/Akt降低更明顯（P<0.05）。
　　5腎組織中mTOR蛋白表達(dá)的比較
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：各組 mTOR蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。

22、
　　6腎組織中p-mTOR蛋白表達(dá)的比較
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果：p-mTOR主要表達(dá)在腎小球系膜基質(zhì)及腎小管-間質(zhì)。對(duì)照組細(xì)胞胞漿及胞核中有少量 p-mTOR蛋白表達(dá)，而模型組及各治療組p-mTOR蛋白表達(dá)增強(qiáng)。與模型組相比，各治療組p-mTOR表達(dá)減弱，尤以聯(lián)合組p-mTOR表達(dá)減弱更明顯。
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組及各治療組p-mTOR/mTOR升高（P<0.05）。與模型組

23、相比，各治療組p-mTOR/mTOR降低（P<0.05），尤以聯(lián)合組p-mTOR/mTOR降低更明顯（P<0.05）。
　　7腎組織中IV-C mRNA比較
　　Real-Time RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組及各治療組IV-C mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05）；與模型組相比，各治療組IV-C mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組相比，聯(lián)合組 IV-C mRNA降低（P<0.05）。與中

24、藥組相比，聯(lián)合組IV-C mRNA表達(dá)降低（P<0.05）。
　　第三部分腎絡(luò)安方促進(jìn)高糖環(huán)境下腎小球足細(xì)胞增殖
　　目的：體外培養(yǎng)足細(xì)胞，予高糖條件造成腎小球足細(xì)胞損傷，以厄貝沙坦為對(duì)照組，觀察腎絡(luò)安方對(duì)高糖環(huán)境下腎小球足細(xì)胞增殖的影響
　　方法：15只SD大鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組，腎絡(luò)安組，厄貝沙坦組，對(duì)照組給予蒸餾水灌胃，腎絡(luò)安組及厄貝沙坦組均按成人臨床用量的20倍灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4天，取血清。采用5％中

25、藥含藥血清對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，用MTT法檢測(cè)對(duì)照組、高糖組、厄貝沙坦組、腎絡(luò)安組足細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)12h、24h、36h、48h的增殖情況。
　　結(jié)果：
　　與對(duì)照組相比，高糖組足細(xì)胞在36h OD值明顯降低（P<0.05），說(shuō)明高糖環(huán)境下足細(xì)胞增殖受到一定抑制作用。與高糖組相比，厄貝沙坦組足細(xì)胞在36h、48h OD值明顯升高（P<0.05），腎絡(luò)安方組在48h OD值明顯升高（P<0.05），說(shuō)明腎絡(luò)安方、厄貝沙坦對(duì)高糖環(huán)

26、境下足細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用。而腎絡(luò)安方組48h OD值與厄貝沙坦組48h OD值無(wú)明顯差異，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腎絡(luò)安方與厄貝沙坦對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　第四部分腎絡(luò)安方治療肥胖型早期糖尿病腎病臨床觀察
　　目的：開(kāi)展腎絡(luò)安方治療肥胖型早期糖尿病腎病臨床實(shí)驗(yàn)研究，觀察治療效果及不良反應(yīng)情況，為開(kāi)發(fā)中藥提供臨床數(shù)據(jù)。
　　方法：選取肥胖型早期DN患者68例，隨機(jī)分為治療組3

27、4例和對(duì)照組34例。對(duì)照組在基礎(chǔ)治療基礎(chǔ)上給予厄貝沙坦片150mg口服，治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上服用協(xié)定處方腎絡(luò)安方400ml，分早晚2次溫服，每日1劑。兩組患者共治療16周。檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，評(píng)價(jià)療效。觀察治療前后中醫(yī)證候積分、腰圍、血液相關(guān)指標(biāo)（SCr、BUN、TC、TG、FBG、HbA1c、Cys C、β2-MG、Hcy），及尿液相關(guān)指標(biāo)（UMCP-1/UCR、URANTES/UCR、UACR、UPCX/UCR、UNephrin/UCR）

28、。
　　結(jié)果：
　　1治療組和對(duì)照組一般資料分布均勻，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2兩組臨床療效的比較
　　63例病例完成實(shí)驗(yàn)。治療組總有效率為90.62%；對(duì)照組總有效率為67.74%。治療組總有效率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　3兩組中醫(yī)證候積分的比較
　　兩組治療前各項(xiàng)癥狀比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。治療組治療后各項(xiàng)癥狀改善明顯優(yōu)于對(duì)照組治療后（P<0.05）。
　　4兩組腰圍的比較

29、
　　兩組腰圍比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　5兩組治療前后血SCr、BUN、TC、TG、FBG、HbA1c的比較
　　兩組指標(biāo)治療前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；治療組治療后各項(xiàng)指標(biāo)均有改善（P<0.05），其中 SCr、TC、TG、FBG、HbA1c較對(duì)照組治療后明顯降低（P<0.05）。
　　6兩組治療前后血Cys C、β2-MG、Hcy的比較
　　兩組Cys C、β2-MG、Hcy指標(biāo)治

30、療前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；治療后兩組指標(biāo)均有降低（P<0.05），而治療組治療后較對(duì)照組治療后各項(xiàng)指標(biāo)降低更明顯（P<0.05）。
　　7兩組治療前后UMCP-1/UCR、URANTES/UCR、UACR的比較
　　治療組治療后UMCP-1/UCR、URANTES/UCR、UACR較本組治療前降低（P<0.05），較對(duì)照組治療后明顯降低（P<0.05）。
　　8 UMCP-1/UCR、URANTES/UCR

31、、UACR相關(guān)性分析
　　UMCP-1/UCR與 URANTES/UCR成正相關(guān)（r=0.561 P=0.000）。UACR與 UMCP-1/UCR成正相關(guān)（ r=0.560 P=0.000）。UACR與URANTES/UCR成正相關(guān)（r=0.489 P=0.000）。
　　9兩組治療前后UPCX/UCR、UNephrin/UCR比較
　　對(duì)照組及治療組治療后UPCX/UCR、UNephrin/UCR均較本組治療前降低

32、（P<0.05），治療組治療后較對(duì)照組治療后降低更明顯（P<0.05）。
　　10 UPCX/UCR、UNephrin/UCR、UACR相關(guān)性分析
　　UPCX/UCR、UNephrin/UCR呈正相關(guān)（r=0.474 P<0.05）。UPCX/UCR、UACR呈正相關(guān)（r=0.447 P<0.05）。UNephrin/UCR、UACR呈正相關(guān)（r=0.473 P<0.05）。
　　11兩組安全性指標(biāo)的檢測(cè)
　　

33、安全性指標(biāo)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯異常。
　　結(jié)論：
　　1腎絡(luò)安方能改善糖尿病腎病大鼠一般狀況，減少尿蛋白排泄，改善腎臟功能，減輕腎臟病理?yè)p害，進(jìn)而延緩腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展。
　　2糖尿病腎病腎臟PI3K/Akt/mTOR通路被激活，IV-C膠原合成增加，細(xì)胞外基質(zhì)積聚，足細(xì)胞 Integrinβ1表達(dá)減弱，抑制足細(xì)胞增殖，促進(jìn)腎小球硬化。而腎絡(luò)安方能抑制 PI3K/Akt/mTOR通路活化，抑制 IV-C膠原合成，上調(diào)足細(xì)