益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病大鼠早期腎病作用及機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1、建立2型糖尿病早期腎病大鼠模型；
　　2、觀察益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠微量白蛋白尿、糖脂代謝及胰島素抵抗的作用；
　　3、研究益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠腎臟組織病理改變及相關(guān)蛋白的作用；
　　4、研究益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠腎臟腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響；
　　5、在證實(shí)益氣散聚固腎方防治2型糖尿病大鼠早期腎病療效確切的基礎(chǔ)上，對(duì)其作用的可能機(jī)制改善胰

2、島素抵抗及拮抗腎臟腎素、血管緊張素系統(tǒng)進(jìn)行研究，為臨床進(jìn)一步研究與應(yīng)用該藥提供較可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、2型糖尿病早期腎病大鼠模型的建立
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠65只，體重180-220g。隨機(jī)分為2組：普通飼料組(進(jìn)食普通飼料)10只和高脂組(進(jìn)食高脂飼料)55只。2組大鼠自由進(jìn)食、飲水4周。4周后，隔夜空腹12小時(shí)，高脂組55只大鼠單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)35mg

3、/kg(體重)；普通飼料組10只大鼠腹腔注射相應(yīng)容量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.4)。注射3天后，尾尖采血測(cè)隨機(jī)血糖，大于等于16.67mmol/L者作為2型糖尿病造模成功大鼠。于注射STZ后第7天用毛細(xì)管眼眶后靜脈叢采血(隔夜空腹12小時(shí))測(cè)血糖、胰島素、血脂，計(jì)算HOMA-IR；代謝籠收集24小時(shí)尿液，檢測(cè)尿微量白蛋白、尿肌酐，計(jì)算尿微量白蛋白/尿肌酐，計(jì)算大鼠24h尿液微量白蛋白排泄率；行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)、腹腔注射胰島

4、素耐量試驗(yàn)評(píng)價(jià)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。與普通飼料組比較以確認(rèn)2型糖尿病大鼠早期腎病模型成功。持續(xù)觀察9周至研究結(jié)束，以確定模型的穩(wěn)定性。
　　2、益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠微量白蛋白尿、糖脂代謝及胰島素抵抗作用的研究
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組：造模成功大鼠隨機(jī)分為6組：模型組、益氣散聚固腎方低劑量組、益氣散聚固腎方中劑量組、益氣散聚固腎方高劑量組、氯沙坦治療組、羅格列酮治療組(每組10只)。普通飼料組作為對(duì)照組(10只)。益氣散

5、聚固腎方低、中、高劑量分別為0.47、1.41、2.82g(生藥)/100g(體重)，氯沙坦劑量為20mg/kg(體重)，羅格列酮?jiǎng)┝繛?mg/kg(體重)。益氣散聚固腎方、氯沙坦和羅格列酮每天灌胃1次，持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)過程中除對(duì)照組大鼠予普通飼料外，余實(shí)驗(yàn)大鼠均予高脂飼料。
　　在藥物干預(yù)后的第4周(腹注STZ后第5周)、第8周(腹注STZ后第9周)，收集24小時(shí)尿液、空腹采血，取腎臟和骨骼肌組織-80℃凍存。檢驗(yàn)指標(biāo)同前，并取對(duì)

6、照組、模型組、益氣散聚固腎方高劑量組、氯沙坦組、羅格列酮組大鼠骨骼肌組織，勻漿、抽提蛋白、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、westernblot方法，檢測(cè)各組骨骼肌組織GLUT-4胞漿、胞膜蛋白表達(dá)。
　　3、益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠腎臟組織病理改變及相關(guān)蛋白作用的研究
　　取對(duì)照組、模型組、益氣散聚固腎方高劑量組、氯沙坦組、羅格列酮組大鼠腎組織做石蠟切片行HE染色、PAS染色，進(jìn)行組織病理形態(tài)學(xué)觀察。
　　

7、Western blot方法檢測(cè)各組腎臟組織nephrin、VEGFR2、p-VEGFR2(Tyr951)、p-VEGFR2(Tyr1175)、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)水平。
　　4、益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠腎臟腎素-血管緊張素系統(tǒng)影響的研究
　　Western blot方法檢測(cè)各組腎臟組織AngⅡ與AT1蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、2型糖尿病大鼠早期腎病模型的建立
　　與普通飼料

8、組大鼠比較，高脂飼料飼養(yǎng)4周后予STZ(35mg/kg)誘導(dǎo)的模型組大鼠在腹注STZ后第7天：空腹血糖(12.82±1.08mmol/Lvs.3.60±0.31mmol/L，P<0.01)、TG(2.24±0.12mmol/Lvs.0.78±0.05mmol/L，P<0.01)、TC(8.40±0.49mmol/Lvs.2.14±0.06mmol/L，P<0.01)、LDL-c(7.84±0.51mmol/Lvs.0.72±0.04mm

9、ol/L，P<0.01)明顯升高，HDL-c(0.57±0.03mmol/Lvs。1.27±0.03mmol/L，P<0.01)明顯降低；24h尿微量白蛋白排泄率(52.59±6.61ug/24hvs.5.01±0.56ug/24h，P<0.01)、尿微量白蛋白/肌酐(17.57±3.37ug/umolvs.8.94±1.19ug/umol，P<0.01)明顯增高，血清肌酐無明顯差異；血清胰島素水平、HOMA-IR評(píng)分明顯增高；體重增加

10、明顯；腹腔注射葡萄糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)證實(shí)模型組胰島素抵抗明顯。結(jié)果提示2型糖尿病早期腎病大鼠模型造模成功。
　　在9周的研究期內(nèi)，與普通飼料組比較，高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的模型組大鼠空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平均明顯升高；高密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低；胰島素水平、體重明顯下降；24h尿微量白蛋白排泄率、尿微量白蛋白/肌酐均明顯升高；血肌酐無明顯變化；胰島素抵抗明顯。結(jié)果提示高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的2型糖

11、尿病早期腎病大鼠模型成功，穩(wěn)定、可靠。
　　2、益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠微量白蛋白尿、糖脂代謝及胰島素抵抗作用的研究
　　益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病的防治效果呈現(xiàn)量效與時(shí)效性，其療程長(zhǎng)、劑量大者效果佳。治療8周后，與模型組比較，益氣散聚固腎方高劑量組：(1)有效減輕微量白蛋白尿：24h尿微量白蛋白排泄率(29.64±6.32ug/24hvs.51.50±6.54ug/24h，P<0.05)、尿微量白蛋白

12、/肌酐(8.52±0.65ug/umolvs。17.21±3.32ug/umol，P<0.01)明顯下降，療效與氯沙坦組相當(dāng)；(2)有效改善糖脂代謝紊亂：下調(diào)空腹血糖水平(12.16±1.00mmol/Lvs.17.65±2.22mmol/L，P<0.01)，TG下調(diào)56.3％(0.87±0.15mmol/Lvs.1.99±0.26mmol/L，P<0.01)、TC下調(diào)49.1％(3.31±0.52mmol/Lvs.6.50±1.04m

13、mol/L，P<0.01)、LDL-c下調(diào)58.8％(2.47±0.50mmol/Lvs.6.00±1.07mmol/L，P<0.01)、HDL-c上調(diào)68％(0.84±0.08mmol/Lvs.0.50±0.03mmol/L，P<0.01)，益氣散聚固腎方改善糖脂代謝紊亂的綜合作用與氯沙坦和羅格列酮相比優(yōu)勢(shì)明顯；(3)不引起體重增加；(4)有效改善胰島素抵抗：減小HOMA-IR評(píng)分，IPGTT示改善葡萄糖耐量異常，ITT示增強(qiáng)胰島素敏

14、感性，促進(jìn)GLUT-4由胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，效果與羅格列酮組相當(dāng)。
　　3、益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠腎臟組織病理改變及相關(guān)蛋白作用的研究
　　治療8周后，與模型組大鼠比較，益氣散聚固腎方高劑量組大鼠腎小球基底膜增厚(9.80±1.02umvs.13.83±2.37um，P<0.05)、細(xì)胞外基質(zhì)增生(0.23±0.03vs.1.06±0.22，P<0.01)明顯減輕。大鼠腎組織足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin表達(dá)明

15、顯上調(diào)，腎組織VEGFR2蛋白表達(dá)及其酪氨酸磷酸化p-VEGFR2(Tyr951)、p-VEGFR2(Tyr1175)水平均明顯下調(diào)，腎組織TNF=α、IL-6蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。
　　4、益氣散聚固腎方對(duì)2型糖尿病早期腎病大鼠腎臟腎素-血管緊張素系統(tǒng)影響的研究
　　治療8周后，與模型組大鼠比較，益氣散聚固腎方高劑量組大鼠腎組織AngⅡ與AT1蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、高脂飲食聯(lián)合單次低劑量STZ腹

16、腔注射可誘導(dǎo)出穩(wěn)定可靠的2型糖尿病及其早期腎病大鼠模型。適合藥物及機(jī)制的研究。
　　2、益氣散聚固腎方可明顯減輕2型糖尿病早期腎病大鼠微量自蛋白尿，治療效果與氯沙坦相當(dāng)。可明顯減輕2型糖尿病早期腎病大鼠腎小球基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增生；上調(diào)腎組織足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin表達(dá)；下調(diào)腎組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的蛋白表達(dá)及磷酸化；下調(diào)腎組織TNF-α，IL-6蛋白表達(dá)?？赊卓?型糖尿病早期腎病大鼠腎臟腎素-血管緊

17、張素系統(tǒng)，雙重阻滯腎組織AngⅡ與AT1蛋白表達(dá)。提示該方可有效防治2型糖尿病早期腎病，其治療效果呈現(xiàn)量效與時(shí)效性，高劑量治療效果最佳。
　　3、益氣散聚固腎方可有效改善2型糖尿病早期腎病大鼠的糖脂代謝紊亂。促進(jìn)模型大鼠骨骼肌組織GLUT-4由胞漿至胞膜的轉(zhuǎn)位，有效改善2型糖尿病早期腎病大鼠胰島素抵抗。作用與羅格列酮相當(dāng)，但不引起體重增加。其綜合調(diào)脂作用與氯沙坦和羅格列酮相比，存在一定優(yōu)勢(shì)。
　　總之，益氣散聚固腎方可改善2