甲狀旁腺素聯(lián)合大鼠BMSCs修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的初步研究.pdf

1、研究背景與目的：由于關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)無(wú)血管、神經(jīng)和淋巴管分布，而且軟骨細(xì)胞為終末分化細(xì)胞并受限于軟骨陷窩中，因此軟骨一旦受損常常會(huì)引發(fā)不可逆的病理變化并導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的減退?，F(xiàn)今還沒(méi)有結(jié)構(gòu)、成分、力學(xué)性質(zhì)等與正常關(guān)節(jié)透明軟骨相似的再生透明軟骨，所以關(guān)節(jié)軟骨受損后的修復(fù)仍是醫(yī)學(xué)界致力解決的難題。現(xiàn)有的多種治療措施，如微骨折術(shù)、骨髓刺激技術(shù)、自體或異體組織(骨膜、軟骨膜、軟骨細(xì)胞)移植等均存在種種缺陷，并且不能獲得滿意的臨床療效，從而限制了它們的臨

2、床應(yīng)用。近年來(lái)運(yùn)用組織工程技術(shù)構(gòu)建的組織工程軟骨替代材料被認(rèn)為是最有可能解決該難題的處理方法。組織工程包括三大因素：種子細(xì)胞、細(xì)胞因子與支架材料。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有多向分化潛能，已經(jīng)被證實(shí)可以向脂肪細(xì)胞、骨與軟骨細(xì)胞等多種組織分化。但是由于體外培養(yǎng)細(xì)胞有失分化的趨勢(shì)以及其在骨髓中的含量稀少，因此促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，應(yīng)用異種異體的BMSCs修復(fù)軟骨缺損是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。
　　甲狀旁腺激素（PTH）是親骨性內(nèi)

3、分泌激素之一，是由甲狀旁腺的主細(xì)胞合成與分泌的多肽類激素，具有分解代謝和合成代謝雙重作用的 G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)蛋白。其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化，骨和軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。PTH1R是PTH和甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrp)的共同受體，分布于多種組織上，貫穿整個(gè)軟骨細(xì)胞的增殖與前肥大演變過(guò)程。體內(nèi)研究表明，PTH能夠有效地維持細(xì)胞的增殖狀態(tài)，在不同的細(xì)胞群體或不同的條件下起著不同的作用，目前的有關(guān)機(jī)制尚無(wú)明確，還需

4、要更多的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。所以本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)集中于 PTH能否促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，并初步探討它們之間相互作用的機(jī)制。
　　應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)軟骨缺損的過(guò)程中，細(xì)胞支架雖然具有運(yùn)載與固定種子細(xì)胞的作用，但是其性質(zhì)、孔徑亦會(huì)影響種子細(xì)胞的性質(zhì)和功能。目前應(yīng)用于組織工程來(lái)修復(fù)軟骨缺損的支架主要有兩類：一類是人工合成的材料，如聚乳酸、聚氨酯類等；一類是生物衍生支架材料，如纖維蛋白凝膠(FG)、脫鈣骨基質(zhì)等。自國(guó)外學(xué)者Homminga等

5、初次研究兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠中的生物學(xué)行為，證實(shí)纖維蛋白凝膠可以使軟骨細(xì)胞維持細(xì)胞形態(tài)與分化增殖活性并形成細(xì)胞外基質(zhì)。相繼有很多的學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了更全面深入的研究表明，纖維蛋白凝膠可作為一種有前途的骨軟骨組織工程的應(yīng)用材料。
　　有鑒于此，本研究欲將PTH誘導(dǎo)后的大鼠BMSCs負(fù)載FG凝膠支架上修復(fù)新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。因此本課題的研究?jī)?nèi)容有：第一，大鼠 BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定以及PTH對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs增

6、殖、成軟骨細(xì)胞分化的影響；第二，在第一部分的基礎(chǔ)上，用PTH/BMSCs/FG異種復(fù)合體移植修復(fù)兔子關(guān)節(jié)軟骨全層缺損模型，并對(duì)其修復(fù)效果進(jìn)行檢測(cè)分析，為其在軟骨組織工程材料應(yīng)用提供依據(jù)，為軟骨缺損的修復(fù)提供新材料和新途徑。
　　方法：
　　1.抽取SD大鼠股骨骨髓，以全骨髓貼壁培養(yǎng)法對(duì)SD大鼠BMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)并傳代。然后通過(guò)觀察其形態(tài)學(xué)，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常見(jiàn)的表面標(biāo)記物 CD44的表達(dá)以及用成骨誘導(dǎo)培

7、養(yǎng)基培養(yǎng)并行堿性磷酸酶染色以作鑒定。
　　2.取第四代 BMSCs，運(yùn)用 PTH在體外對(duì)其向成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，使用MTT法檢測(cè)PTH對(duì)BMSCs的增殖分化影響，并通過(guò)免疫組化檢測(cè)觀察細(xì)胞胞漿內(nèi) II型膠原蛋白的表達(dá)。同時(shí)在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)收取樣本使用激光共聚焦顯微鏡術(shù)(LSCM)檢測(cè)BMSC內(nèi)的II型膠原蛋白和蛋白多糖的表達(dá)情況以及胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度。
　　3.選取48只重約2.5kg的新西蘭大白兔制備關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，

8、雙側(cè)膝關(guān)節(jié)都納入實(shí)驗(yàn)，并隨機(jī)分成4組，每組動(dòng)物12只。PTH干預(yù)組：PTH/BMSCs/FG復(fù)合體移植修復(fù)組；非PTH干預(yù)組：BMSCs/FG復(fù)合體移植修復(fù)組；缺損組：不作任何移植修復(fù)的曠置組；正常組：正常兔關(guān)節(jié)組。分別在術(shù)后4W，8W，12W各處死16只兔子，獲取雙側(cè)的股骨髁標(biāo)本，對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行大體、組織學(xué)與免疫組化染色觀察并利用國(guó)際軟骨修復(fù)學(xué)會(huì)(ICRS)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分驗(yàn)證各組的修復(fù)效果；同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-ti

9、me PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)修復(fù)組織中II型膠原與蛋白多糖的表達(dá)情況。然后將所獲得的數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. SD大鼠原代BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，呈紡錘形或多角形，但是傳代后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)迅速，每5d~7d即可傳下一代，且每一次傳代均獲得純度較高的BMSCs。傳至第4代即可取得純度較好的BMSCs。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，第4代B

10、MSCs的CD44呈高表達(dá)，陽(yáng)性率是95.76％。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的第4代BMSCs進(jìn)行細(xì)胞堿性磷酸酶染色，胞漿內(nèi)可觀察到較多的棕紅色顆粒，堿性磷酸酶呈陽(yáng)性表達(dá).
　　2.大鼠BMSCs經(jīng)PTH體外培養(yǎng)后，由細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PTH處理實(shí)驗(yàn)組的BMSCs的生長(zhǎng)增殖能力分別較抑制組與對(duì)照組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而抑制組和對(duì)照組之間的細(xì)胞生長(zhǎng)能力沒(méi)有顯著的差異。在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)行 II型膠原免疫組化染色與激光共聚焦顯微鏡術(shù)檢測(cè)，結(jié)果

11、表明，實(shí)驗(yàn)組BMSC細(xì)胞的II型膠原與蛋白多糖的表達(dá)均優(yōu)于對(duì)照組，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，差別越明顯。在7d、14d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組鈣離子的熒光峰值分別為7.91±2.34、5.15±1.58，對(duì)照組鈣離子的熒光峰值分別為5.37±2.55、2.71±0.89。鈣離子熒光峰值測(cè)量顯示實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，兩時(shí)間點(diǎn)p<0.05。
　　3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在術(shù)后第12周，PTH干預(yù)PTH/BMSC/FG復(fù)合體組關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)被透明樣的組織完全

12、修復(fù)，表面平整光滑，修復(fù)組織內(nèi)可見(jiàn)典型的軟骨陷窩形成并含大量的軟骨細(xì)胞，排列趨向于柱狀，軟骨下潮線連貫，可見(jiàn)完整的軟骨下骨，與周圍的正常軟骨組織分界消失；修復(fù)組織大體和組織學(xué)ICRS評(píng)分PTH干預(yù)PTH/BMSC/FG復(fù)合體組顯著優(yōu)于非PTH干預(yù)BMSC/FG復(fù)合體組和缺損組，與正常關(guān)節(jié)組差別不明顯；II型膠原和蛋白聚糖免疫組化染色均為陽(yáng)性，而且其的平均光密度值，mRNA相對(duì)表達(dá)量，蛋白平均積分光密度值都要優(yōu)于非PTH干預(yù)BMSC/FG

13、復(fù)合體組和缺損組，與正常關(guān)節(jié)組無(wú)顯著差別。
　　結(jié)論：
　　1.采用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法對(duì)大鼠BMSC進(jìn)行分離培養(yǎng)可獲得純度較高的BMSC。
　　2. PTH能夠誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞增殖分化并刺激BMSC分泌Collagen II和Aggrecan，其可能的作用機(jī)制是胞內(nèi)依賴Ca2+信號(hào)通路的激活。
　　3.用經(jīng) PTH誘導(dǎo)后的大鼠 BMSC負(fù)載于纖維蛋白凝膠(FG)支架建立的PTH/BMSC/FG異種復(fù)合體修