復(fù)合自體骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)的關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)(SACECM)取向支架修復(fù)羊膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、研究背景:隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展和進步,關(guān)節(jié)軟骨損傷的早期診斷和治療受到重視,關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)無神經(jīng)、血管、淋巴的特殊性,決定了其難以自行修復(fù)。全層骨軟骨一旦損傷只能夠由纖維軟骨修復(fù),但是這種修復(fù)組織缺乏正常軟骨組織所具有的生物學(xué)、生物化學(xué)、和生物力學(xué)特性,因此在關(guān)節(jié)活動過程中壓力的刺激下很容易發(fā)生退變。因此,各種各樣的手術(shù)(關(guān)節(jié)成形術(shù)、鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)等),被應(yīng)用于臨床,試圖刺激骨髓干細胞,產(chǎn)生具有接近透明軟骨特性的軟骨來修復(fù)軟骨缺損,事實證明

2、了,這些修復(fù)組織因壓力的刺激很快發(fā)生退變。目前組織工程的出現(xiàn)作為一門新興學(xué)科,已迅速成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一門國際性的前沿學(xué)科,受到科研人員的高度重視。它綜合利用了工程學(xué)原理及方法和生命科學(xué)技術(shù),以適當(dāng)?shù)纳锟山到獠牧蠟檩d體支撐,整合入種子細胞,在模擬接近體內(nèi)生物環(huán)境的條件下進行培養(yǎng),形成“細胞—材科”復(fù)合物,利用此復(fù)合物重建和修復(fù)病損的組織,隨著支架材料的不斷降解和種子細胞的不斷增殖,復(fù)合物逐漸形成了具有與正常組織相同的生物活性和功能的新

3、生組織,并將缺損修復(fù)。此方法突破了傳統(tǒng)的治療模式,為組織再生甚至器官重建開辟了新的思路和方法。
　　 目的:本研究以中國山羊為動物模型,研究羊骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)在體外分離純化、培養(yǎng)擴增的方法;評價BMSC復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)(ACECM)源性取向支架的效果;并探討利用自體骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)作為種子細胞,整合ACECM源性取向支架,修復(fù)羊膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的可行性。
　　 方法:(1)抽取羊髂骨骨銹

4、血,體外分離骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs),培養(yǎng)擴增,并對培養(yǎng)的BMSC細胞進行成骨誘導(dǎo),成脂肪誘導(dǎo),成軟骨誘導(dǎo),確定其是具有多向分化能力的BMSCs。(2)將鑒定證實為具有正常表型的BMSCs與ACECM取向支架復(fù)合后繼續(xù)培養(yǎng),觀察ACECM取向支架內(nèi)細胞生長情況,并對細胞與支架復(fù)合效果進行鑒定。(3)于山羊股骨髁負重面制作一直徑6mm全層軟骨缺損,分別以:空白(缺損內(nèi)未植入任何組織物);單純ACECM取向支架植入修復(fù);BMSCs+AC

5、ECM取向支架植入修復(fù)三種方式治療,并分別于術(shù)后3個月、6個月取材進行大體觀察,組織學(xué)檢查,病理評分和力學(xué)檢測。
　　 結(jié)果:(1)由髂骨抽取的骨髓血分離、培養(yǎng)、擴增出來的骨髓基質(zhì)干細胞向成骨方向誘導(dǎo),經(jīng)茜素紅染色為陽性;向成脂肪誘導(dǎo),經(jīng)油紅“O”染色為陽性;向軟骨誘導(dǎo),經(jīng)蕃紅“O”、甲苯胺藍、Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性,證實擴增的細胞為具有多向分化能力的骨髓基質(zhì)干細胞。(2)骨髓基質(zhì)干細胞與支架復(fù)合后繼續(xù)培養(yǎng)7天,做死活細胞

6、染色,活細胞占95％以上。掃描電鏡觀察:細胞在取向支架上體外培養(yǎng)一周后見細胞大部分展開呈多角形,與支架粘附良好,有大量細胞基質(zhì)的分泌,且廣泛分布到支架內(nèi)部,沿著支架的孔道分布排列成柱狀結(jié)構(gòu),其橫截面見細胞呈圓球形,均勻分布在支架孔道內(nèi)。(3)BMSCs復(fù)合ACECM取向支架修復(fù)羊負重區(qū)關(guān)節(jié)面軟骨缺損,從大體觀察、組織學(xué)、力學(xué)等實驗結(jié)果進行比較,單因素統(tǒng)計學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)各組均有不同程度的組織修復(fù),其中以BMSCs復(fù)合ACECM取向支架組效果