BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、科技發(fā)展，社會進步，人們生活質(zhì)量和平均壽命不斷提高，人類已經(jīng)步入老齡化社會。老齡化社會給我們帶來一系列的挑戰(zhàn)，其中，關(guān)節(jié)軟骨的磨損、退變，甚至關(guān)節(jié)軟骨的剝脫、缺損，是運動醫(yī)學(xué)亟待解決的熱點問題。此外，工業(yè)革命使我們的生活更趨便捷，各種交通事故等高能量損傷也日益增加，臨床中常見到膝髖等關(guān)節(jié)軟骨大面積缺損，甚至合并開放性損傷，給關(guān)節(jié)外科帶來發(fā)展的機遇。
　　 關(guān)節(jié)軟骨存在先天不足，其不受神經(jīng)支配，缺乏血液供應(yīng)，軟骨細胞自身增殖能力很

2、低，以致?lián)p傷軟骨的自身修復(fù)能力非常有限；一旦關(guān)節(jié)軟骨損傷，難以自行修復(fù)；此外，關(guān)節(jié)軟骨生存在一個相對封閉的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，主要靠滑膜維持關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，受外周循環(huán)的影響極低；一旦污染，難以快速清除。對于關(guān)節(jié)疾病，常需要更大劑量更長療程的全身應(yīng)用抗生素等藥物，療效不確切的同時藥物副作用成為最大威脅；雖然關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射抗生素等藥物能提高局部藥物濃度，減少靜脈給藥的副作用，但是常需要反復(fù)穿刺和嚴格無菌操作，有潛在關(guān)節(jié)腔內(nèi)感染的高風(fēng)險，因此，關(guān)節(jié)軟

3、骨損傷在修復(fù)過程中難以維持自身微環(huán)境的穩(wěn)定和自我修復(fù)，若合并關(guān)節(jié)感染更是災(zāi)難性病癥!本課題通過體外構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球培養(yǎng)體系，了解該緩釋微球的藥物緩釋情況，觀察慶大霉素對BMSCs軟骨細胞分化的影響；并建立動物模型驗證該緩釋微球修復(fù)軟骨的短期效果，為臨床開放性軟骨缺損，或伴關(guān)節(jié)內(nèi)感染的修復(fù)研究建立實驗基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.掌握體外BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球構(gòu)建的技術(shù)；掌握

4、建立關(guān)節(jié)軟骨缺損的動物模型和自體骨膜覆蓋組織工程軟骨移植修復(fù)技術(shù)。
　　 2.觀察慶大霉素在體外三維緩釋微球中的釋放情況；及其對BMSCs軟骨分化的影響。
　　 3.在兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，植入BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球，觀察其對關(guān)節(jié)軟骨缺損的短期修復(fù)效果。
　　 4.為開放性或感染性軟骨缺損的修復(fù)提供實驗基礎(chǔ)，為進一的步臨床軟骨修復(fù)提供基礎(chǔ)性研究。
　　 方法:
　　 1.BMS

5、Cs的來源嚴格無菌條件下，自四周齡新西蘭兔的髂后上嵴各抽取骨髓1-1.5ml，采用密度梯度離心法并結(jié)合貼壁篩選法分離、純化BMSCs，并進行體外平面培養(yǎng)擴增，對細胞表型、純度進行鑒定。
　　 2.制備慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球準確稱取3.0g慶大霉素，溶于10ml雙蒸水中，在酸堿測試儀上，用4mol/L氫氧化鈉液滴定溶液的PH值至7.4，依次加入10μl的HEPES緩沖液、0.0875g的氯化鈉、三倍標準濃度藻酸鈉液20ml，

6、即配制成含慶大霉素3.0的慶大霉素.藻酸鈉凝膠30ml，其中藻酸鈉為二倍標準濃度；抽取不同組別藻酸鈉凝膠10ml，滴到裝有氯化鈣溶液40ml、5mmol/L的HEPES緩沖液，PH為7.4的培養(yǎng)皿中，凝珠聚化呈乳白色或透明淡黃色。將裝有檢測樣本的透析袋放置在已加入100ml0.9％氯化鈉溶液的密閉容器中，置于搖床，設(shè)定各個時間段，精確抽取10ml浸泡液作為檢測樣品，取樣送金黃色葡萄球菌抑菌檢測，計算凝珠的包封率、藥物釋放率，并立即向容器

7、中補加0.9％氯化鈉液10ml，始終保持容積不變。
　　 3.BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋凝珠的構(gòu)建精確稱取3.0g慶大霉素，溶解于10ml的雙蒸水中：在酸堿度測試儀上，用4mol/L氫氧化鈉滴定至溶液PH值至7.4，加入HEPES緩沖液10μl，0.0875g氯化鈉，攪拌使其混勻；再加入三倍標準濃度的藻酸鈉液20ml，即配制成含慶大霉素3.0g的慶大藻酸鈉凝膠30ml。取0.5ml兔第二代BMSCs懸液，滴入2ml的慶

8、大霉素-藻酸鈉凝膠，充分混勻后，即成BMSCs-慶大霉素-藻酸鈉凝膠。與BMSCs-藻酸鈣三維凝珠培養(yǎng)進行比較。觀察BMSCs的形態(tài)、生長增殖及其表型變化。
　　 4.三維緩釋微球的移植將BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣凝珠填塞在兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，采用自體同側(cè)脛骨上段內(nèi)側(cè)骨膜縫合固定。
　　 5.建立兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型和實驗分組選12只健康新西蘭兔，用直徑5mm鉆頭鉆直徑為5.0mm的全層軟骨缺損創(chuàng)面，深度約5mm。分成

9、實驗組(BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球移植組)；實驗對照組(BMSCs-藻酸鈣三維微球移植組)；單純骨膜覆蓋組；空白對照組(不做任何處理)共四組。術(shù)后12周處理實驗動物，切取實驗側(cè)股骨髁以遠骨質(zhì)，對軟骨缺損處修復(fù)組織進行大體和光鏡觀察，對組織切片行HE染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色。
　　 結(jié)果:
　　 1.傳代的BMSCs貼壁能力很強，經(jīng)體外平面擴增的細胞大小、形態(tài)相似，多呈紡錘形或短梭形；免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯

10、示：第1-3代BMSCs不表達CD34，而表達CD44、CD105；Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陰性，提示是未分化的BMSCs。
　　 2.本實驗中使用金黃色葡萄球菌菌株及培養(yǎng)皿均是按標準嚴格控制，所得結(jié)果具有明顯的可比性，為實驗的準確性提供肯定性依據(jù)。各組慶大霉素-藻酸鈣緩釋微球在30天的檢測期內(nèi)均能到達金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)>2μg/ml，其中，U組慶大霉素的包封率較高，30天釋放慶大霉素的累計釋放總量較大。

11、>　　 3.在BMSCs-慶大霉素-藻酸鹽三維緩釋微球中，BMSCs的生物學(xué)活性表現(xiàn)良好。大體觀察和倒置顯微鏡觀察結(jié)果均顯示，BMSCs生長狀態(tài)較好，生長曲線比較正常；三維緩釋微球培育2周后，Ⅱ型膠原染色和甲苯胺藍染色均呈陽性，為軟骨細胞表型。這與BMSCs-藻酸鈣三維微球的培育結(jié)果一致。
　　 4.成功建立兔膝關(guān)節(jié)股骨髁關(guān)節(jié)面軟骨缺損的動物模型。12只健康新西蘭兔術(shù)后12周均成活。實驗組軟骨缺損面由乳白色組織填充，與周邊組織

12、色澤相近，界限清晰，無明顯間隙。組織切片可見兩側(cè)都與周圍軟骨組織愈合，未見載體材料的殘留，細胞呈圓形，周圍已形成軟骨陷窩；但細胞數(shù)目明顯多于正常組織，且排列紊亂。Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色為陽性；實驗對照組與實驗組結(jié)果一樣；單純骨膜覆蓋組修復(fù)組織呈白色，表面凹陷，與周圍組織境界清晰，細胞呈成纖維細胞樣改變，表面粗糙凹陷，與周圍組織愈合差，底部少量骨組織形成。Ⅱ型膠原免疫組化染色陰性；空白對照組缺損區(qū)明顯凹陷，底部可見粉紅色肉芽組織增生，未

13、見明顯軟骨組織充填。
　　 結(jié)論:
　　 1.BMSCs存在于骨髓組織，取材方便，細胞貼壁能力很強，通過密度梯度離心法，并結(jié)合貼壁篩選法，分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞。經(jīng)檢測，CD44、CD105抗體免疫組化染色均呈陽性，Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色呈現(xiàn)陰性，這些生物學(xué)特征與BMSCs一致。通過該混合方法能成功獲取更高純度、未分化的BMSCs。
　　 2.藻酸鈣緩釋微球是良好的抗生素緩釋載體，三組慶大霉素藻酸鈣緩釋微

14、球，在大部分30天各檢測時間段中，慶大霉素的釋放濃度都高于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(2μg/ml)。含10％慶大霉素的U組緩釋微球具有相對最好的包封率和最大的藥物釋放量，與慶大霉素骨水泥相似，是BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋凝珠的最佳三維載體支架。由于該支架的組織降解性，慶大霉素的早期釋放情況比抗生素骨水泥好。
　　 3.在慶大霉素緩慢釋放的狀態(tài)下，BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球使BMSCs保持較好的生物學(xué)形

15、態(tài)，生長增殖正常，培養(yǎng)至第7-21天，BMSCs增殖最明顯，最后分化為軟骨細胞；Ⅱ型膠原抗體免疫組化和甲苯胺藍染色結(jié)果均呈陽性改變，且與BMSCs-藻酸鈣三維微球培育結(jié)果一致。該三維微球體外培育具有良好的組織相容性，能達到BMSCs軟骨化的需要。
　　 4.在體內(nèi)，BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球移植組和BMSCs-藻酸鈣三維微球移植組能得到相同的軟骨缺損修復(fù)效果。進而說明，在體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境下，BMSCs-慶大霉素-藻酸