應(yīng)力損傷和PGE2對共培養(yǎng)的PCL細胞和滑膜細胞中LOX家族及MMP-1、2、3表達的影響.pdf

1、后交叉韌帶(Posterior cruciate ligament，PCL)在維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定中起重要作用，但嚴重的PCL損傷后卻難以完全恢復(fù)其原有的生物力學(xué)特征。PCL損傷過程中，機械應(yīng)力不僅導(dǎo)致PCL成纖維細胞及其鄰近的滑膜細胞出現(xiàn)損傷，還會進一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促使炎性細胞因子的產(chǎn)生并作用于PCL成纖維細胞及滑膜細胞。細胞遷移是損傷組織修復(fù)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，但PCL損傷后產(chǎn)生的細胞因子對PCL成纖維細胞及滑膜細胞遷移的影響并不清

2、楚。據(jù)報道，機械應(yīng)力損傷和炎性細胞因子均能顯著刺激韌帶成纖維細胞和滑膜細胞表達和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)，并與韌帶損傷后的自我修復(fù)能力密切相關(guān)。另外，賴氨酰氧化酶家族(Lysyl oxidases，LOXs)通過介導(dǎo)細胞外基質(zhì)中膠原的交聯(lián)也參與組織損傷后修復(fù)過程的調(diào)節(jié)。但是，PCL損傷后機械應(yīng)力的損傷刺激和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的細胞因子前列腺素E2(Prostaglandin E2)對P

3、CL成纖維細胞和滑膜細胞中LOXs及MMPs表達影響的研究國內(nèi)外尚未見報道。并且，既往對PCL成纖維細胞的研究也較少考慮其與滑膜細胞間的相互作用對這兩種細胞的生物特性如細胞遷移、基因表達等的影響。
　　目的：
　　1、在PCL成纖維細胞或滑膜細胞單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的條件下，分別研究共培養(yǎng)環(huán)境和前列腺素E2對這兩種細胞遷移的影響；
　　2、在PCL成纖維細胞和滑膜細胞共培養(yǎng)的條件下，研究12％機械應(yīng)力損傷對這兩種細胞中LOX

4、s、MMP-1、2、3的表達和MMP-2活性的影響；
　　3、在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷共同作用的基礎(chǔ)上，研究PGE2對兩種細胞中LOXs、MMP-1、2、3的表達和MMP-2活性的影響。
　　通過對以上內(nèi)容的研究，從而探討嚴重的PCL損傷后自身難以滿意愈合可能的細胞和分子生物學(xué)機制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人PCL成纖維細胞和滑膜細胞，并用Transwell共培養(yǎng)此兩種細胞。細胞劃痕愈合實驗檢測前列腺素E2對單培養(yǎng)組

5、和共培養(yǎng)組24 h時PCL成纖維細胞和滑膜細胞遷移的影響。將機械應(yīng)力損傷和PGE2對LOXs和MMP-1、2、3表達影響的研究分為兩部分。
　　第一部分主要研究不同處理因素對PCL成纖維細胞的影響，實驗分為4組。
　　P①組：PCL成纖維細胞單培養(yǎng)組；
　　P②組：共培養(yǎng)組(PCL成纖維細胞培養(yǎng)于Transwell下室)；
　　P③組：共培養(yǎng)+12％應(yīng)力損傷組；
　　P④組：共培養(yǎng)+12％應(yīng)力損傷+PGE2

6、組。
　　第二部分主要研究以上處理因素對滑膜細胞的影響，實驗也分為4組。
　　S①組：滑膜細胞單培養(yǎng)組；
　　S②組：共培養(yǎng)組(滑膜細胞培養(yǎng)于Transwell下室)；
　　S③組：共培養(yǎng)+12％應(yīng)力損傷組；
　　S④組：共培養(yǎng)+12％應(yīng)力損傷+PGE2組。
　　處理后1、3、6和12 h提取細胞總RNA，熒光定量PCR檢測LOXs和MMP-1、2、3的表達；處理后12、24、48和72 h提取細胞培

7、養(yǎng)液，明膠酶譜法檢測MMP-2的活性。
　　結(jié)果：
　　1、與單培養(yǎng)的PCL成纖維細胞相比，共培養(yǎng)保持了更佳的細胞生長狀態(tài)，并使PCL成纖維細胞24 h時的遷移率增加至單培養(yǎng)的2.28倍；但PGE2分別使單培養(yǎng)和共培養(yǎng)下PCL成纖維細胞24 h時的遷移率降低至相應(yīng)未處理對照組的72％和63％。
　　2、共培養(yǎng)也促進了滑膜細胞的生長和遷移，使其24 h時的遷移率增加至單培養(yǎng)的1.48倍；但PGE2分別使單培養(yǎng)和共培養(yǎng)下滑

8、膜細胞的遷移率降低至相應(yīng)對照組的86％和76％。
　　3、與單培養(yǎng)比較，共培養(yǎng)顯著增加了PCL成纖維細胞中LOXs的表達，分別使共培養(yǎng)12 h時LOX和LOXL1-4的表達增至單培養(yǎng)的1.24、1.25、1.48、1.66和1.17倍；但12％應(yīng)力損傷分別使共培養(yǎng)下PCL成纖維細胞中LOXs的表達降低至共培養(yǎng)未處理組的64.3％、41.6％、54％、44.6％和19.7％；在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷共同作用的基礎(chǔ)上，PGE2進一步使其表達

9、降低至29％、32％、28.4％、27.1％和12％。
　　4、共培養(yǎng)使滑膜細胞中LOXs的表達分別增加至單培養(yǎng)的1.41、1.5、1.66、1.38和1.37倍；但應(yīng)力損傷使LOXs的表達分別降至共培養(yǎng)未處理組的61％、54.5％、51.7％、60.4％和57.7％；在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷共同作用的基礎(chǔ)上，PGE2進一步使其表達降低至52.8％、51.5％、48％、50％和51％。
　　5、共培養(yǎng)12 h的PCL成纖維細胞中M

10、MP-1、2、3的表達分別較單培養(yǎng)組增高至1.35、1.73和1.45倍；共培養(yǎng)下，力學(xué)損傷分別使MMP-1、2、3的表達增高至共培養(yǎng)未處理組的4、1.67和3倍；PGE2在此基礎(chǔ)上進一步增高其表達至8.81、4.2和5.61倍。
　　6、共培養(yǎng)使滑膜細胞中MMP-1、2、3的表達也增高，分別達單培養(yǎng)對照組的1.78、1.55和1.31倍；應(yīng)力損傷使其表達分別增高至共培養(yǎng)組的1.88、1.17和2.93倍；前列腺素E2在共培養(yǎng)和應(yīng)

11、力損傷的基礎(chǔ)上進一步增高其表達至2.75、2.01和3.23倍。
　　7、與單培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)使PCL成纖維細胞中72 h時MMP-2的活性增高至1.92倍；共培養(yǎng)下，應(yīng)力損傷也使其活性增高達共培養(yǎng)組的1.72倍；PGE2在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷的基礎(chǔ)上進一步使其活性增高至共培養(yǎng)組的6.3倍。
　　8、與單培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)使滑膜細胞72 h時MMP-2的活性也增高達單培養(yǎng)組的1.78倍；共培養(yǎng)下，應(yīng)力損傷增高MMP-2的活性至

12、共培養(yǎng)組的1.5倍；PGE2在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷的基礎(chǔ)上進一步使其活性增高至共培養(yǎng)組的2.37倍。
　　結(jié)論：
　　1、共培養(yǎng)下的PCL成纖維細胞和滑膜細胞之間存在著密切的交流，兩者相互作用，共同促進細胞的生長和遷移。
　　2、PGE2顯著抑制了單培養(yǎng)和共培養(yǎng)下PCL成纖維細胞和滑膜細胞的遷移。
　　3、共培養(yǎng)使PCL成纖維細胞和滑膜細胞中LOXs的表達均增高，同時也增加了MMP-1、2、3的表達和MMP-2的活性

13、。
　　4、應(yīng)力損傷使共培養(yǎng)下PCL成纖維細胞和滑膜細胞中LOXs的表達明顯降低，同時使MMP-1、2、3的表達及MMP-2的活性增高。
　　5、在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷共同作用的基礎(chǔ)上，PGE2進一步降低兩種細胞中LOXs的表達；同時也進一步增高MMP-1、2、3的表達及MMP-2的活性。
　　6、應(yīng)力損傷和PGE2可能通過抑制細胞遷移、介導(dǎo)LOXs和MMPs表達或活性的異常從而破壞細胞外基質(zhì)合成和降解之間的平衡兩方面的作