2-氯乙醇暴露對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性損傷及MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:1，2-二氯乙烷(Dichloroethane，1，2-DCE)是工業(yè)上常用的有機(jī)溶劑，主要用于粘合劑的稀釋劑。1，2-DCE為無色、易揮發(fā)、具有氯仿氣味的油狀液體，屬高毒類。中毒性腦病是亞急性1，2-DCE職業(yè)中毒的主要臨床表現(xiàn)，腦水腫為其主要的病理改變過程。迄今為止，有關(guān)亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫機(jī)制的研究資料很少，亟待進(jìn)行深入研究。1，2-DCE在人和動(dòng)物體內(nèi)主要經(jīng)細(xì)胞色素P4502E1代謝生成2-氯乙醇和氯乙醛，它們

2、具有比1，2-DCE更強(qiáng)的毒性，在1，2-DCE引起的毒效應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。因此，探討2-氯乙醇直接導(dǎo)致的神經(jīng)毒性效應(yīng)尤為必要。腦水腫分為細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫，星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AS）水腫是其早期病理過程中最突出的特征。AS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞群體，不僅對(duì)神經(jīng)元起支持和營(yíng)養(yǎng)作用，而且參與血腦屏障的誘導(dǎo)與維持及細(xì)胞外環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)控等。當(dāng)血液中外來化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入腦組織時(shí)，AS應(yīng)是其初始蓄積并損傷的主要

3、靶細(xì)胞。傳統(tǒng)的腦水腫形成機(jī)制學(xué)說包括“能量代謝障礙”、“氧自由基損傷”、“神經(jīng)遞質(zhì)興奮性毒性損傷”及“血腦屏障損傷”等。近年來，隨著人們對(duì)腦水腫機(jī)制研究的不斷深入，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表達(dá)異常及其調(diào)控機(jī)制在血管源性腦水腫形成和發(fā)展過程中的作用受到了廣泛的關(guān)注。本研究擬通過體外細(xì)胞毒理學(xué)試驗(yàn)研究，以原代培養(yǎng)AS為研究對(duì)象，探討2-氯乙醇對(duì)AS線粒體功能和谷氨酸代謝的影響，以及MAP

4、K信號(hào)通路對(duì)2-氯乙醇誘導(dǎo)AS中MMP-2和MMP-9表達(dá)的調(diào)控作用，從細(xì)胞毒性和血管源性腦水腫兩個(gè)層面深入研究2-氯乙醇對(duì)AS的損傷及其在腦水腫發(fā)生機(jī)制中的作用，為揭示1，2-DCE中毒性腦水腫的發(fā)生機(jī)制提供新的研究方向和實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。
　　方法:1、取出生1-3天Wistar仔鼠，取大腦皮質(zhì)剪碎，胰酶消化使細(xì)胞分散，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，經(jīng)傳代純化后，GFAP染色法鑒定純度。2、用滅菌后的去離子水配

5、制成1 M(mol/L)2-氯乙醇儲(chǔ)備液。使用前，將2-氯乙醇儲(chǔ)備液用培養(yǎng)液稀釋，用含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備成含不同2-氯乙醇濃度的培養(yǎng)液。以2-氯乙醇為染毒物，第一部分2-氯乙醇對(duì)AS的損傷研究共分為4組，培養(yǎng)液中含2-氯乙醇濃度分別為0、7.5、15和30 mM，培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)并采集圖像，AlamarBlue法檢測(cè)細(xì)胞活力，應(yīng)用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）

6、、一氧化氮(nitricoxide，NO)、乳酸、ATP和活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)含量，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase、caspase-9、caspase-3和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性，線粒體膜電位、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔狀態(tài)。采用免

7、疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)AS中GLAST、GLT-1和GS的蛋白表達(dá)。采用Western Blot和Real time RT-PCR法分別檢測(cè)Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase、caspase-9、caspase-3、iNOS、GLAST、GLT-1和GS蛋白和mRNA的含量。3、第二部分MAPK信號(hào)通路對(duì)2-氯乙醇誘導(dǎo)AS中MMP-2和MMP-9表達(dá)的調(diào)控作用的研究分三方面，首先，采用免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)AS中MMP-2

8、和MMP-9的蛋白表達(dá)，Western Blot和Real time RT-PCR法分別檢測(cè)MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表達(dá)水平。其次，將細(xì)胞隨機(jī)分7組:對(duì)照組（包括空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和抑制劑對(duì)照組）、暴露組和干預(yù)組（包括低、中和高劑量抑制劑預(yù)處理組）。暴露組細(xì)胞培養(yǎng)液中2-氯乙醇濃度為30 mM，暴露24小時(shí)。三種信號(hào)通路干預(yù)組細(xì)胞分別接受其特異性抑制劑處理一小時(shí)后，按上述暴露組細(xì)胞處理方法暴露24小時(shí)。收集細(xì)胞檢測(cè)p3

9、8、ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表達(dá)水平，檢測(cè)磷酸化p38(p-p38)、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和磷酸化JNK1/2(p-JNK1/2)的蛋白含量。最后，探討過氧化物清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)對(duì)2-氯乙醇誘導(dǎo)ROS的生成以及MAPK活化過程的影響。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組、暴露組和干預(yù)組（包括低、中和高劑量NAC預(yù)處理組）。暴露組細(xì)胞處理方法同上。干預(yù)

10、組細(xì)胞分別經(jīng)5、50和500μM NAC預(yù)處理。一小時(shí)后，干預(yù)組細(xì)胞按上述暴露組細(xì)胞處理方法，暴露24小時(shí)后，收集細(xì)胞分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，以及p-p38、p-ERK1/2和p-JNK1/2的蛋白含量。4、統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS20.0軟件進(jìn)行。多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。
　　結(jié)果:1、2-氯乙醇對(duì)AS的毒性損傷研究結(jié)果顯示，隨暴露劑

11、量增大，AS脫壁增多，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。各2-氯乙醇暴露組的細(xì)胞活力隨暴露濃度的升高而下降。15和30mM2-氯乙醇暴露組AS中GSH含量顯著低于對(duì)照組，相反，NO含量、iNOS的活性、蛋白以及mRNA的含量顯著高于對(duì)照組。各濃度2-氯乙醇暴露組AS中Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性和蛋白含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而各組間Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase的mRNA表達(dá)水平

12、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、本研究中線粒體功能由細(xì)胞內(nèi)乳酸含量、ATP含量、ROS含量、mPTP開放狀態(tài)、線粒體膜電位以及caspase-3/9的表達(dá)進(jìn)行評(píng)價(jià)。15和30 mM2-氯乙醇暴露組AS中乳酸和ROS含量顯著高于對(duì)照組，各濃度2-氯乙醇暴露組AS中ATP含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。各2-氯乙醇暴露組的線粒體膜電位顯著低于對(duì)照組，15和30 mM2-氯乙醇暴露組AS中mPTP開放明顯（P＜0.05）。15和30 mM2-氯乙

13、醇暴露組的裂解caspase-9和caspase-3的蛋白含量顯著高于對(duì)照組和7.5 mM2-氯乙醇暴露組。此外，30 mM2-氯乙醇暴露組的caspase-9和caspase-3酶活性顯著高于對(duì)照組和7.5 mM2-氯乙醇暴露組。各組的caspase-9和caspase-3mRNA表達(dá)水平之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、隨染毒劑量增加，GS、GLAST和GLT-1的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。15和30mM2-氯乙醇暴露組GS的酶活性和蛋白含量顯著低

14、于對(duì)照組，30 mM2-氯乙醇暴露組GS的mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。30mM2-氯乙醇暴露組GLAST和GLT-1的蛋白含量顯著低于其他組，15和30mM2-氯乙醇暴露組GLAST的mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，各組間GLT-1的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、隨2-氯乙醇暴露劑量的增加，各暴露組AS中MMP-2和MMP-9的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，15和30 mM2-氯乙醇暴露組MMP-9的蛋白

15、含量顯著高于對(duì)照組和7.5 mM2-氯乙醇暴露組(P＜0.05)。30mM2-氯乙醇暴露組MMP-9的mRNA表達(dá)水平顯著高于其他各組，僅30 mM2-氯乙醇暴露組MMP-2的蛋白含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。5、與空白對(duì)照組相比，抑制劑對(duì)照組AS中p38、p-p38、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、MMP-2和MMP-9的蛋白含量顯著下降，而它們?cè)诒┞督M中的蛋白含量顯著上升(P＜0.05)。而且與暴露組相比，各

16、劑量SB202190抑制劑組AS中的p-p38以劑量依賴方式下降，中高劑量SB202190抑制劑組AS中的MMP-2和MMP-9的蛋白含量亦隨之顯著下降(P＜0.05)。除低劑量U0126和SP600125抑制劑組中的p-ERK1/2和p-JNK1/2之外，其各自兩組抑制劑組中p-ERK1/2、p-JNK1/2和MMP-9的蛋白含量顯著低于暴露組(P＜0.05)。三個(gè)SP600125抑制劑組的MMP-2的蛋白含量顯著低于暴露組(P＜0.

17、05)。另一方面，與空白對(duì)照組相比，三個(gè)抑制劑對(duì)照組AS中MMP-9的mRNA表達(dá)水平顯著下降，而暴露組卻顯著上升(P＜0.05)。此外，中高劑量SB202190抑制劑組AS中MMP-9的mRNA表達(dá)水平顯著低于暴露組（P＜0.05）。而且高劑量SB202190抑制劑組的MMP-9的mRNA表達(dá)水平顯著低于中劑量SB202190抑制劑組（P＜0.05）。高劑量U0126和SP600125抑制劑組的MMP-9的mRNA表達(dá)水平顯著低于低劑

18、量U0126和SP600125抑制劑組（P＜0.05）。然而，各處理組間p38、ERK1、ERK2、JNK1和JNK2的mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6、暴露組中細(xì)胞內(nèi)ROS的含量顯著高于對(duì)照組，而NAC干預(yù)組的ROS含量顯著低于暴露組。高劑量NAC干預(yù)組AS中p-p38以及三組NAC干預(yù)組AS中p-JNK1/2的蛋白含量顯著低于暴露組(P＜0.05)。NAC干預(yù)組AS中p-ERK1/2的蛋白含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:1、2-