甘肅省冬蟲夏草遺傳多樣性分析和人工培養(yǎng)條件的研究.pdf

1、冬蟲夏草是我國一種藥食兼用的傳統名貴中藥材,現代研究證實具有重要的藥用價值。甘肅省是我國冬蟲夏草的主要產地之一。為調查甘肅省三個主要產區(qū)所產冬蟲夏草種類的系統發(fā)育及遺傳分化,本研究開展了以甘肅省幾個冬蟲夏草主產區(qū)的蟲草資源進行分子系統學分析和相關研究。主要研究結果如下:
　　 1.本研究從來自甘肅三個主要產區(qū)采集的冬蟲夏草上分離到18個菌株,篩選出最佳培養(yǎng)基,研究其對溫度的適應性,低溫下生長較慢,18℃為最適生長溫度,25℃及其

2、以上不能生長,并首次通過在培養(yǎng)基中斜插蓋玻片的方法在光學顯微鏡下清晰觀察菌絲和分生孢子形態(tài)；通過特殊培養(yǎng)在三角瓶中長出與野生冬蟲夏草“草頭”相同的子實體。從形態(tài)學上判定分離的菌株為中國被毛孢。
　　 2.采用改進的CTAB法對菌株基因組DNA進行提取。經紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。方法是,在提取緩沖液中加入 PVP和β-巰基乙醇,同時采用 tris-平衡飽和酚／氯仿／異戊醇,氯仿／異戊醇相結合的抽提法,通過加入3mo

3、l／L NaAc,經冰凍無水乙醇沉降和70％乙醇多次洗滌。結果顯示,經改良后的 CTAB法提取的基因組DNA片段完整、純度高、質量好滿足后續(xù)實驗要求。
　　 3.通過優(yōu)化ISSR反應體系首次確定了冬蟲夏草25μL ISSR-PCR反應體系為10×PCRBuffer2.5μL;模板20ng；dNTP0.12 mmol／L；Mg2+1.5 mmol／L；ISSR引物0.9μmol／L；Taq DNA聚合酶0.5U。
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4、.采用簡單序列例重復(ISSR)區(qū)間擴增多態(tài)性分析和18S rDNA序列分析法,對18個菌株進行標記和系統發(fā)育分析。在ISSR分析中顯示出不同地域的樣本間遺傳分化較大,遺傳多樣性較豐富；同一地域不同地點間樣本存在遺傳分化；同一地點樣本間存在較小遺傳分化；分離自同一株蟲草上的菌株之間不存在遺傳分化。在18S rDNA系統發(fā)育分析中顯示出在同一地域不同地點樣本間和同一地點不同樣本間具有較小的遺傳分化；分離至同一株蟲草上不同部位的菌株不存在遺

5、傳分化。
　　 5.通過PCR技術擴增出18個菌株間18S部分序列,通過測序分析。結果顯示18SrDNA序列長372bp。序列比對發(fā)現,各分離物與中國被毛孢(Hirsutella sinensis)之間僅有1-2個堿基的差異,相似性高達99％,遺傳距離在0.01以下。說明18個菌株與H.sinensis彼此間在基因水平上是高度一致的。為了進一步比較分離菌株無性型與中國被毛孢之間的關系,以蛹蟲草(Cordyceps militar

6、is)和球孢菌(Cordyceps bassiana)作外群,并與同源性相關的菌物構建分子系統樹,結果顯示18個分離菌株的無性型為中國被毛孢。
　　 6.首次采用苯酚-硫酸法測定中國被毛孢菌絲體多糖含量,高碘酸鈉比色法測定甘露醇含量,反相高效液相色譜法測定腺苷和蟲草素含量。結果表明,天然冬蟲夏草中存在蟲草素且在甘肅不同產區(qū)分離得到的蟲草菌多糖含量在1.66％～2.36％之間,甘露醇含量在2.04％～5.72％之間,蟲草素和腺苷的

7、含量分別在47.213～76.927μg／g、249.778～439.797μg／g；同一產區(qū)不同地方分離到的蟲草菌多糖含量在1.79％～2.00％之間,甘露醇含量在1.62％～1.79％之間,蟲草素和腺苷的含量分別在45.331～49.96μg／g、92.404～376.375μg／g。通過顯著性分析說明不同產地菌株間的活性成分含量差異顯著；同一產區(qū)菌株間除腺苷外活性成分含量差異不顯著。從多糖含量和腺苷含量上可以看出從甘南冬蟲夏草上分