冬蟲夏草無性型原生質(zhì)體制備及種群遺傳多樣性研究.pdf

1、冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)的、珍貴的中草藥。目前，野生冬蟲夏草產(chǎn)量急劇下降，而價格飛漲。為改變現(xiàn)狀，人工培育冬蟲夏草成為研究熱點。了解冬蟲夏草菌種的遺傳多樣性以及開展原生質(zhì)體融合（Protoplast fusion）育種，將為實現(xiàn)上述目標提供研究基礎(chǔ)和前提。本文應(yīng)用不同的分離方法以及分離不同部位的組織獲得了數(shù)十株冬蟲夏草無性型中國被毛孢菌株，研究其原生質(zhì)體制備的最佳工藝；同時，采用ISSR分子技術(shù)和交配型基因mat1-2-1獲得了冬蟲夏草種內(nèi)的

2、相關(guān)遺傳多樣性信息。通過研究獲得以下結(jié)果。
　　 以冬蟲夏草無性型中國被毛孢為原材料，通過液體培養(yǎng)獲得菌絲體，經(jīng)酶解處理后在不同條件下獲得原生質(zhì)體，以研究酶的種類及濃度、滲透壓穩(wěn)定種類及濃度、酶液pH 值以及酶解時間的不同，對中國被毛孢原生質(zhì)體制備的影響。結(jié)果顯示中國被毛孢菌株原生質(zhì)體的最佳制備條件為：使用濃度配比分別為4mg/ml和3mg/ml的Yatalase和Glucanex酶，在1.0MKCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，酶液pH值

3、為6時，酶解3h，所得的原生質(zhì)體量最多。
　　 從60個引物中篩選出7個擴增條帶清晰且多態(tài)性好的ISSR引物，并摸索合適的PCR反應(yīng)條件，用于40株菌株的PCR反應(yīng)。共得到62條帶，其中多態(tài)性條帶38條，多態(tài)性百分率僅為63.15％，遺傳相似系數(shù)范圍在0.78~1.00之間。進行UPGMA法聚類分析，得出：40株中國被毛孢菌株并沒有完全按照不同的分離方法聚為3個類型。單子囊孢子分離法獲得的菌株，區(qū)別于其它菌株而單獨聚為一類，其它

4、分離法獲得的菌株混合聚類?？梢姡瑔巫幽益咦泳甑腎SSR指紋圖譜與其它菌株有較明顯差異。總的看來，同一地區(qū)的中國被毛孢各菌株間具有一定的遺傳多樣性，但遺傳差異不是太大。
　　 參照Zhang等的交配型基因mat1-2-1的擴增引物，對本實驗分離獲得的40株菌株進行PCR特異擴增。取其中7個拼接好的MAT1-2-1區(qū)堿基序列，與來自GenBank數(shù)據(jù)在內(nèi)的共11個樣品構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)本實驗采自青海的7個供試菌株，連同GenBa