地木耳遺傳多樣性、生物活性及人工培養(yǎng)研究.pdf

1、地木耳(Nostoc commune Vaucher)屬藍(lán)藻綱(Cyanophyceae),念珠藻科(Nostocaceae),念珠藻亞科(Nostocoideae)念珠藻屬(Nostoc)藻類。地木耳含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類物質(zhì)、黃酮、礦質(zhì)元素、維生素等,具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌等作用,是一種有一定食用價(jià)值與醫(yī)療保健價(jià)值的天然食品。然而,由于市場(chǎng)需求日益增加、環(huán)境污染加劇,導(dǎo)致地木耳野生資源日益減少,品質(zhì)降低;加之

2、野生地木耳在自然生長(zhǎng)中泥沙含量多,不容易清除,也會(huì)影響地木耳的食用價(jià)值;因此,有必要對(duì)地木耳的遺傳多樣性、營(yíng)養(yǎng)成分、人工培養(yǎng)等進(jìn)行研究,以便開發(fā)與利用地木耳資源。本研究通過對(duì)我國(guó)14個(gè)省市57個(gè)地區(qū)264個(gè)地木耳樣品進(jìn)行研究,對(duì)保護(hù)我國(guó)地木耳的遺傳資源、提高地木耳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、減少地木耳中的有害成分有重要的理論意義,同時(shí)對(duì)規(guī)?；斯づ囵B(yǎng)、開發(fā)地木耳產(chǎn)品有極大的應(yīng)用價(jià)值。具體研究結(jié)果如下:
　　1.地木耳的遺傳多樣性分析:
　　

3、(1)本研究從14個(gè)省市57個(gè)地區(qū)收集地木耳樣品264份,分布于我國(guó)西南、西北、華北、華中和華東等地木耳主產(chǎn)區(qū)。
　　(2)改良CTAB法提取地木耳DNA雜質(zhì)少,質(zhì)量高。從100條RAPD引物中篩選出12條引物對(duì)57個(gè)居群264個(gè)地木耳樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共獲得136條帶,其中多態(tài)性帶131條,多態(tài)性百分率為96.3％;對(duì)其中18條帶進(jìn)行多態(tài)信息含量(PIC)分析顯示,18條帶均為中度多態(tài)性條帶。
　　(3)用POPGENE

4、分析發(fā)現(xiàn),地木耳物種水平的遺傳多樣性( PPB=88.04％)高于居群水平的遺傳多樣性( PPB=59.77％)。基因分化系數(shù)(Gst=0.6337)、AMOVA方差分析(PHIst=0.5712)、Shannon’s居群分化系數(shù)((Hsp-Hpop)/Hsp=0.6322)與基因流(Nm=0.2891)均顯示出地木耳居群間遺傳變異與遺傳分化水平高于居群內(nèi)。
　　(4)江西宜春居群(JXYC)的遺傳多樣性最高;重慶長(zhǎng)壽居群(CQC

5、S)、湖南祁東居群(HNQD)、安徽池州居群(AHCZ)和甘肅平?jīng)鼍尤?GSPL)遺傳多樣性較低。
　　(5)用POPGENE分析遺傳距離(D)與遺傳相似性系數(shù)(I),結(jié)果發(fā)現(xiàn)遺傳距離(D)范圍在0.0265~0.7098之間,而遺傳相似性系數(shù)(I)在0.3608~0.9738之間;聚類分析發(fā)現(xiàn),57個(gè)居群地木耳可分為8個(gè)類群,264個(gè)地木耳樣品可分為9個(gè)類群。
　　(6)遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)系數(shù)r=0.0248(p

6、>0.05),表明遺傳距離與地理距離之間相關(guān)性不明顯;Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)與海拔高度的相關(guān)系數(shù)為r=0.6207(p<0.05),Shannon信息指數(shù)(I)與海拔高度的相關(guān)系數(shù)為r=0.7081(p<0.05),說明海拔高度對(duì)地木耳的遺傳分化有顯著影響。
　　2.地木耳中元素含量測(cè)定:
　　(1)用ICP-AES法測(cè)定地木耳中元素含量,儀器檢測(cè)限范圍在0.0018~0.068μg/mL之間;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD

7、)值在0.28％~1.87％之間;加標(biāo)回收率在95.8％~105.6％之間,說明該方法準(zhǔn)確率和精密度高。
　　(2)5種人體必需元素中,Fe、V含量最高,分別為93.58~242.5 mg/kg和6.28~52.24 mg/kg;Mn、Zn、Cu含量次之。
　　(3)部分地區(qū)地木耳中5種必需元素Fe、V、Mn、Zn、Cu的含量高于黑木耳和黃傘,但地木耳中4種生理毒性元素 Al、Cd、Pb、Ti的含量均低于黑木耳和黃傘,說明地

8、木耳營(yíng)養(yǎng)成分高,具有一定的開發(fā)價(jià)值。
　　3.地木耳中多糖、脂類物質(zhì)及總黃酮含量、活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn):
　　(1)57個(gè)居群地木耳多糖含量為13.68％~22.62％、脂類物質(zhì)含量為1.54％~2.79％、總黃酮含量為0.41％~0.76％;紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)多糖之間、脂類物質(zhì)之間紅外光譜峰形相似,峰位置相近,峰強(qiáng)度有差異,說明不同地區(qū)地木耳多糖與脂類物質(zhì)組分和含量有差異;地木耳脂類物質(zhì)中,非極性脂含量最高,強(qiáng)極性脂含量其

9、次,弱極性脂含量最低;地木耳中總黃酮主要包含黃酮、二氫黃酮、黃酮醇和查爾酮4種類型。
　　(2)地木耳中總黃酮抗氧化作用與抑菌作用高于多糖與脂類物質(zhì)。
　　(3)四川宜賓居群(SCYB)地木耳多糖、脂類物質(zhì)和總黃酮含量均最高,其含量分別為22.62％±1.08％、2.79％±0.34％和0.76％±0.11％;其抗氧化活性與抑菌活性最強(qiáng),具有極大的開發(fā)價(jià)值。
　　4.應(yīng)用紅外光譜鑒定地木耳,結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　(1)

10、應(yīng)用主成分與載荷因子分析發(fā)現(xiàn),第一主成分累計(jì)可信度值達(dá)到81.85％,PC1與PC2累計(jì)可信度值達(dá)到95.94％;確定了3400~3410 cm-1、1640~1650 cm-1和1030~1040 cm-1三個(gè)分析靈敏區(qū);3400~3410 cm-1對(duì)PC1的貢獻(xiàn)最大,其次為1640~1650 cm-1;地木耳中化學(xué)成分的差異主要體現(xiàn)在糖類物質(zhì)上,其次為脂類和蛋白質(zhì)。
　　(2)聚類分析發(fā)現(xiàn),57個(gè)居群地木耳可被分為7大表征群;

11、不同地區(qū)的地木耳紅外光譜分化不明顯;地木耳主成分與地理距離相關(guān)性不大,與地木耳菌生長(zhǎng)的環(huán)境有極大的相關(guān)性。
　　(3)不同地區(qū)地木耳的PC1差異大,通過主成分分析可以鑒別不同地區(qū)的地木耳,為快速鑒別地木耳的產(chǎn)地與質(zhì)量提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　5.對(duì)地木耳人工培養(yǎng)條件及保健飲料制備進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　(1)最佳培養(yǎng)條件為搖床搖動(dòng)速率40 rpm、培養(yǎng)溫度25℃、光照時(shí)間“16 h光/8 h暗”;搖床搖動(dòng)速率對(duì)地

12、木耳人工培養(yǎng)影響最大,培養(yǎng)溫度次之,光照時(shí)間影響最小。
　　(2)四川宜賓居群(SCYB)地木耳在BG11液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)最迅速,培養(yǎng)56天后,其鮮重增加46.3倍,干重增加35.6倍;其多糖、脂類物質(zhì)、總黃酮含量高于野生地木耳、黑木耳和黃傘;人工培養(yǎng)地木耳中,多糖含量比野生地木耳高25.69％,脂類物質(zhì)含量比野生地木耳高2.05％,總黃酮含量比野生地木耳高52.63％。人工培養(yǎng)地木耳中必需元素Cu、Fe、Mn、Zn含量高于

13、野生地木耳、黑木耳和黃傘,而生理毒性元素Al、Cd、Pb、Ti含量低于野生地木耳、黑木耳和黃傘。
　　(3)培養(yǎng)3天后藻殖段可形成藻絲;小菌體在培養(yǎng)14天后形成,其最大直徑在培養(yǎng)21天后達(dá)到200~250μm;培養(yǎng)28天后大菌體形成,其最大直徑在培養(yǎng)42天后達(dá)到5 mm;培養(yǎng)49天后,形成片狀體,其最大直徑在培養(yǎng)56天后達(dá)到15 mm。
　　(4)小菌體、大菌體與片狀體破裂可釋放藻殖段和藻絲繼續(xù)生長(zhǎng),形成新的菌體。地木耳人工