應(yīng)用全基因組siRNA文庫(kù)篩選黑色素瘤耐藥細(xì)胞株及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：2011年 FDA批準(zhǔn) BRAF抑制劑維羅非尼用于治療 BRAF V600E突變以及晚期不能手術(shù)切除的黑素瘤患者。該藥在經(jīng)過(guò)一段臨床實(shí)踐治療后，普遍產(chǎn)生耐藥性。針對(duì)此問(wèn)題，我們構(gòu)建覆蓋人基因組的siRNA文庫(kù)質(zhì)粒、運(yùn)用siRNA文庫(kù)篩選耐藥黑色素瘤細(xì)胞株、高通量測(cè)序、測(cè)序后單一片段功能的驗(yàn)證以及逆轉(zhuǎn)錄病毒感染條件的探索這個(gè)5個(gè)方面進(jìn)行了研究。以期待能從基因沉默這一方面進(jìn)一步闡述臨床腫瘤耐藥機(jī)制。
　　方法：通過(guò)化學(xué)法合成中間

2、含有19個(gè)堿基隨機(jī)排列的片段，以PCR擴(kuò)增該片段互補(bǔ)序列形成雙鏈DNA，并作為Gibson組裝的插入片段。在此基礎(chǔ)上，在逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架 pSOK質(zhì)粒的特定位置通過(guò) Gibson Assembly的方法，將含有隨機(jī)排列19個(gè)堿基的siRNA片段組裝進(jìn)入該質(zhì)粒并進(jìn)行相關(guān)鑒定。
　　選取伴有 BRAF V600E突變的黑色素瘤細(xì)胞株 A375、MDA-MB-435和 UACC62三種細(xì)胞。利用 FDA批準(zhǔn)用于治療伴有BRAF V600E

3、突變的黑色素瘤藥物維羅非尼和曲美替尼進(jìn)行文庫(kù)篩選。確定細(xì)胞致死劑量后經(jīng)siRNA文庫(kù)篩選耐藥細(xì)胞株，經(jīng)結(jié)晶紫染色、IC50檢測(cè)、Q-PCR檢測(cè)耐藥相關(guān)基因、EMT相關(guān)基因等進(jìn)行各個(gè)方面的驗(yàn)證。同時(shí)，我們對(duì)篩選得到的耐藥細(xì)胞株提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序片段后送檢Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)11對(duì)單一序列過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建單一片段過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，并進(jìn)行耐藥相關(guān)檢測(cè)。
　　為確保每個(gè)目

4、的細(xì)胞有且只有一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染，設(shè)計(jì)了2種逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒(帶G418抗性的pSEN-GFP質(zhì)粒以及帶BSD抗性的pSEB-RFP質(zhì)粒)，同時(shí)檢測(cè)病毒滴度、最佳感染時(shí)間和病毒儲(chǔ)存時(shí)間穩(wěn)定性等相關(guān)問(wèn)題。
　　結(jié)果：
　　1.該siRNA文庫(kù)質(zhì)粒一次組裝數(shù)目約1.08x106，同時(shí)插入文庫(kù)片段質(zhì)粒的陽(yáng)性率為91.7％，并且隨機(jī)挑選的15個(gè)陽(yáng)性菌落質(zhì)粒測(cè)序沒(méi)有發(fā)生重疊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該siRNA文庫(kù)質(zhì)粒已充分覆蓋人基因組。

5、>　　2.維羅非尼對(duì) UACC62的致死劑量為50uM，而 A375和MDA-MB-435細(xì)胞的致死劑量皆為25uM。曲美替尼對(duì)三種細(xì)胞的致死劑量為20uM。
　　3.依次使用抗腫瘤藥維羅非尼和曲美替尼的致死劑量對(duì)感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫(kù)的 A375細(xì)胞進(jìn)行了篩選，分別成功篩選出 A375V、A375T、A375VT和A375TV耐藥細(xì)胞株。
　　4.與對(duì)照組A375相比，耐維羅非尼細(xì)胞A375V對(duì)達(dá)拉非尼(靶向BRAF蛋白)、

6、曲美替尼(靶向 MEK蛋白)以及順鉑和吉西他濱(二者皆為臨床一線細(xì)胞毒性藥物)藥物具有更強(qiáng)的耐藥性。
　　5.對(duì)照組細(xì)胞A375和A375n19的IC50為0.18 uM， A375V的半數(shù)致死劑量大大提升至5.09uM。
　　6. Tq-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的13個(gè)耐藥相關(guān)基因、RAS/RAF/MEK信號(hào)通路相關(guān)基因在耐藥細(xì)胞株(A375V、A375T、A375VT和 A375TV)中呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(shì)。EMT相關(guān)基

7、因 CDH1、CDH2、VIM、FOX2、Snail1和OCLN基因在耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)也呈上調(diào)趨勢(shì)。
　　7.成功提取耐藥細(xì)胞株的基因組 DNA并設(shè)計(jì)測(cè)序引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增以送檢Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。
　　8.隨機(jī)挑選了11個(gè)單一siRNA片段，9種片段的導(dǎo)入都能夠增加原細(xì)胞A375的耐藥性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也通過(guò)結(jié)晶紫染色進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　9.隨機(jī)挑選的耐藥相關(guān)基因、RAS/RAF/MEK信號(hào)通路

8、以及EMT相關(guān)基因的表達(dá)情況在A375TBRs(過(guò)表達(dá)單一siRNA片段)中都呈上調(diào)趨勢(shì)。
　　10.挑選耐藥細(xì)胞株測(cè)序所得峰度值最高的5個(gè)siRNA片段，并經(jīng)生物信息學(xué)分析確定這些片段的下游基因，這些基因在耐藥細(xì)胞株(A375V、A375T、A375VT和A375TV)和A375TBRs中都呈上調(diào)趨勢(shì)。
　　11.選取TBR1、TBR3和TBR8(三種siRNA片段)靶向的ncRNA設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物(ncRNA-1到 nc

9、RNA-25)，經(jīng) Tq-PCR檢測(cè)，這些ncRNAs在耐藥細(xì)胞株(A375V、A375T、A375VT和 A375TV)和A375TBR3/5/7/8/9/10中都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。
　　12.逆轉(zhuǎn)錄病毒最佳收集時(shí)間為病毒包裝后36h、48h、60h以及72h，感染A375細(xì)胞的最佳時(shí)間為4h左右。
　　13.隨著逆轉(zhuǎn)錄病毒儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，所有病毒組的病毒滴度都呈逐漸下降趨勢(shì)，4天后下降趨勢(shì)最為明顯。
　　14.在相同逆