小鼠黑色素瘤TSC分選鑒定及其耐藥性初探.pdf

1、當(dāng)前,對腫瘤的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、免疫治療、物理治療等,這些方法的基本思路是把腫瘤看作是一個均質(zhì)性的整體,以減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量,最大限度清除腫瘤病灶為目的。但是部分腫瘤細(xì)胞對化療、放療的抵抗從而造成腫瘤的復(fù)發(fā)是腫瘤治療的主要障礙。因此,探索腫瘤發(fā)病機(jī)制,尋找有效的治療途徑,已成為進(jìn)一步提高腫瘤病人生存率的關(guān)鍵。 越來越多的證據(jù)表明,腫瘤是一種干細(xì)胞疾病。研究顯示,腫瘤組織中存在極少量的腫瘤干細(xì)胞(Tumor Stem

2、Cell,TSC),具有無限增生的潛能,對化療、放療具有抗性,在腫瘤中充當(dāng)干細(xì)胞的角色,是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥的決定性因素。因此,尋求從腫瘤細(xì)胞中分離TSC的有效方法,對丁研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸,腫瘤耐藥機(jī)制以及腫瘤的靶點(diǎn)治療研究均有十分重要的意義。 一些研究顯示SP細(xì)胞(Side population cell)篩選分析是可能用于TSC的鑒定方法之一。SP細(xì)胞可以快速將進(jìn)入細(xì)胞核的親脂的熒光染料排出胞外,在

3、熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)(FACS)檢測時表現(xiàn)為不著色或低著色。許多研究者從體外傳代腫瘤細(xì)胞系中分離出SP亞群,顯示SP細(xì)胞與TSC有很多共性,如高致瘤性,高表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2/BCRP,有的表達(dá)有相應(yīng)SC的標(biāo)記分子如CD34,CD133等。雖然SP細(xì)胞只占整個腫瘤細(xì)胞群體的很少部分,但是篩選SP細(xì)胞群可以富集TSC,因此目前許多學(xué)者認(rèn)為,在缺乏顯著的TSC分子標(biāo)記的情況下,SP細(xì)胞的篩選分析可以作為TSC鑒定的一種實(shí)用而簡易的重要途徑

4、之一。 由于對腫瘤的治療研究,大部分是先在動物腫瘤模型上進(jìn)行,根據(jù)人源性腫瘤細(xì)胞與動物源性腫瘤細(xì)胞有諸多相似的生物學(xué)特性,所以分離與鑒定動物腫瘤TSC對開展TSC的基礎(chǔ)和臨床研究均有重要意義。為此,我們選擇小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10細(xì)胞,對其TSC進(jìn)行了相關(guān)的分析研究。 目的： 本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,先對CD44+CD133+CD24+表型的B16F10細(xì)胞異體移植的致瘤性作了研究,再進(jìn)一步利用FACS技術(shù)

5、,從鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10細(xì)胞中分選出SP和Non-SP細(xì)胞亞群,并在體內(nèi)外鑒定其生物學(xué)特性,分析B16F10細(xì)胞中SP細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞樣的特性,以及和化療藥耐藥的關(guān)系,探索從B16F10細(xì)胞株中富集TSC的有效方法,并對TSC耐藥機(jī)制進(jìn)行初探。 方法： 1.CD44+CD133+CD24+B16F10細(xì)胞異體移植致瘤性研究。經(jīng)直線加速器高能X射線照射的Balb/c小鼠4小時后,皮下接種3×105CD44+C

6、D133+CD24+B16F10細(xì)胞,監(jiān)測小鼠腫瘤生長情況及生存時間。 2.SP和Non-SP細(xì)胞分選。B16F10細(xì)胞懸液加入Hoechst3342,然后其中一組加入ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑維拉帕米,通過FACS檢測B16F10細(xì)胞中SP細(xì)胞比例,基于FACS分選技術(shù)對B16F10細(xì)胞中SP和Non-SP細(xì)胞分選。 3.SP和Non-SP細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)特性研究。對分選的SP和Non-SP細(xì)胞分別用細(xì)胞計數(shù)法連續(xù)檢測細(xì)

7、胞增殖活性,用無血清培養(yǎng)觀察其生長特性,用克隆形成試驗觀察其克隆形成率,按不同數(shù)鼉級SP和Non-SP細(xì)胞接種C57BL/6小鼠,比較其致瘤性,用MTT法檢測對化療藥的耐受性,用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測SP和Non-SP細(xì)胞的CD分子表型,綜合鑒定SP和Non-SP細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性。 4.采用RT-PCR方法半定量分析SP細(xì)胞及Non-SP細(xì)胞Wnt-2及ABCG2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,并進(jìn)一步用熒光定量PCR方法檢測ABC

8、G2的表達(dá)量,對TSC耐藥機(jī)制進(jìn)行探討。 結(jié)果： 1.CD44~+CD133~+CD24~+B16F10細(xì)胞異體移植致瘤性 經(jīng)照射的第1組Balb/c小鼠,在接種CD44~+CD133~+CD24~+細(xì)胞的第15天,有2只長出腫瘤；其余兩只未長出腫瘤,分別在第20、28天死亡。經(jīng)照射的第2組小鼠,在接種野生型細(xì)胞后第15、18、19、25天分別死亡,無腫瘤生長。未經(jīng)照射的第三、第四組接種CD44~+CD133~+

9、CD24~+B16F10細(xì)胞和野生型細(xì)胞50天后,未長出腫瘤。 2.B16F10細(xì)胞中SP細(xì)胞的分選 通過FACS檢測結(jié)果顯示,B16F10細(xì)胞系中存在SP細(xì)胞,SP細(xì)胞的比例為0.96％。 3.B16F10細(xì)胞系中SP細(xì)胞的生物學(xué)特性鑒定 (1)形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 置倒置顯微鏡下及HE染色觀察,發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞較Non-SP細(xì)胞體積小。 (2)細(xì)胞增殖實(shí)驗 SP細(xì)胞在普通培養(yǎng)基上生長5天,用

10、細(xì)胞計數(shù)法連續(xù)檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗結(jié)果顯示,SP細(xì)胞生長活力顯著高于Non-SP細(xì)胞,差異有顯著性意義(p<0.05)。 (3)無血清培養(yǎng)試驗 用含表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)20μg/L和堿性成纖維生長因子(Fibroblast Growth Factor-basic,bFGF)20μg/L的無血清1640培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)含血清培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞可在含生長因子的無血清培養(yǎng)基中懸浮存

11、活、增殖,形成自由漂浮的細(xì)胞球,細(xì)胞球可連續(xù)傳代,若重新接種于含血清培養(yǎng)基中可重新貼壁分化,貼壁分化后細(xì)胞形態(tài)與直接在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)無明顯差別,而Non-SP細(xì)胞不能無血清培養(yǎng)基中存活。 (4)克隆形成實(shí)驗 將SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞等量接種于平板、軟瓊脂和96孔板上,結(jié)果表明SP細(xì)胞的克隆形成率顯著高于Non-SP細(xì)胞,而且SP細(xì)胞形成的克隆大多呈球形,其內(nèi)的細(xì)胞為層疊、集中,Non-SP細(xì)胞形成的克隆形態(tài)扁平,

12、有些細(xì)胞排列松散。 (5)C57BL/6小鼠皮下接種致瘤性試驗 將相同數(shù)量的SP和Non-SP細(xì)胞移植到C57BL/6小鼠皮下,1×10~4個SP細(xì)胞即可使8只小鼠中5只鼠成瘤(5/8),而1×10~4個Non-SP細(xì)胞接種8只小鼠都沒有成瘤(0/8);在3×10~4個SP細(xì)胞實(shí)驗組,7只鼠形成腫瘤(7/8),而該數(shù)量的Non-SP細(xì)胞只能使(3/8)鼠成瘤。該結(jié)果表明SP細(xì)胞的致瘤性顯著強(qiáng)于Non-SP細(xì)胞。

13、(6)SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對化療藥物長春新堿的耐受性 用MTT法檢測SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對化療藥物長春新堿的耐藥性。結(jié)果顯示,在長春新堿0.5μg/ml濃度作用72h對Non-SP細(xì)胞細(xì)胞的生長抑制明顯,對SP細(xì)胞的生長抑制不明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。 (7)SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞中CD133~+、CD44~+、CD24~+細(xì)胞的比例檢測 采用FCM檢測SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞中C

14、D133+、CD44+、CD24+細(xì)胞的比例,結(jié)果顯示SP細(xì)胞中CD44+、CD133+、CD24+細(xì)胞表型的比例顯著高于Non-SP細(xì)胞。 4.TSC耐藥機(jī)制的初探 對SP細(xì)胞的生物學(xué)特性研究結(jié)果提示,B16F10細(xì)胞株中的SP細(xì)胞可能是TSC樣細(xì)胞,對其與耐藥有關(guān)的分子ABCG2及Wnt-2 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了鑒定。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SP及Non-SP細(xì)胞中均存在ABCG2及Wnt-2基因的表達(dá),但SP細(xì)胞顯著

15、高于Non-SP細(xì)胞。進(jìn)一步用熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示,SP細(xì)胞的ABCG2分子表達(dá)量是Non-SP細(xì)胞的6.27倍。 結(jié)論： 1.具有CD44+CD133+CD24+表型的B16F10細(xì)胞異體移植到Balb/c小鼠有較強(qiáng)的致瘤性,提示該表型細(xì)胞具有TSC樣特性。 2.B16F10細(xì)胞株中的SP細(xì)胞在普通培養(yǎng)基上增殖能力、在體外克隆形成能力、在無血清培養(yǎng)可連續(xù)傳代能力、在C57BL/6小鼠的高致瘤性及對化療藥