靶向RhoC基因慢病毒載體構建及對黑色素瘤細胞生物學行為和DTIC耐藥性影響.pdf

1、目的：黑色素瘤是體表腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤，其高度侵襲轉移性和對于傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性被認為是黑色素瘤治療和預后的最大障礙。RhoC作為腫瘤轉移相關因子可通過多種轉移相關機制參與腫瘤的侵襲與轉移，是控制腫瘤轉移的分子開關，RhoC有望成為抑制腫瘤轉移的重要靶位。RNAi技術是目前公認快速有效的基因沉默方式，有利于進行基因治療和表達缺失下的功能研究。
　　 目前多項研究證實RNAi技術可通過調(diào)節(jié)和關閉基因表達進而調(diào)控細胞的各種

2、生命活動，但應用RNAi技術靶向RhoC基因慢病毒干擾載體的構建、RhoC基因沉默對黑色素瘤生物學行為，尤其是侵襲轉移能力的影響以及對化療藥物耐藥逆轉性的研究尚未見報道。本研究擬利用RNAi技術，以慢病毒作為基因載體，以人黑色素瘤A375細胞作為研究對象，以轉移相關基因RhoC作為靶基因，研究靶向RhoC基因慢病毒干擾載體的構建及沉默RhoC基因對體外培養(yǎng)A375細胞生物學行為包括細胞增殖、細胞凋亡、細胞粘附能力、細胞侵襲能力的影響：腫

3、瘤轉移相關因子基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP-2)、上皮鈣粘附素(E-cadherin)的表達水平的變化；以及對于治療黑色素瘤的化療藥物氮烯咪胺(Dacarbazine，DTIC)耐藥性的逆轉并分析其可能機制，旨在探討RhoC基因在黑色素瘤細胞生物學行為中的作用，為RhoC作為惡性腫瘤轉移相關基因治療靶位的可行性、為逆轉腫瘤耐藥及基因治療提供實驗室依據(jù)，為進一步應用RNAi技術治療腫瘤提供新

4、的思路。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)RhoC編碼區(qū)基因信息設計構建三對pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體，并轉染人黑色素瘤A375細胞，應用熒光定量PCR和Western blot檢測三對pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體對A375細胞RhoC mRNA及蛋白表達的沉默效應從而篩選出最有效的靶序列。
　　 2.將RNAi效應最佳的序列進一步構建至pcDNA6.2-EmGFP-miR中并進

5、行慢病毒包裝構建形成靶向RhoC pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體，測序并感染A375細胞，進一步應用熒光定量PCR和Western blot檢測對RhoC mRNA及蛋白表達的沉默效應。
　　 3.體外實驗中，將pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體感染人黑色素瘤A375細胞，應用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC基因沉默后轉移相關基因MMP-2，E-cadherin mRNA及

6、蛋白表達；應用Transwell小室細胞侵襲實驗檢測A375細胞侵襲能力；應用細胞粘附實驗檢測對層粘連蛋白和纖維粘連蛋白的粘附能力；應用MTT法檢測細胞增殖；應用流式細胞儀檢測細胞凋亡；應用MTT法檢測對化療藥物氮烯咪胺(DTIC)耐藥性的逆轉率。同時應用上述各種方法對對照組相應指標進行檢測。
　　 統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析。多樣本均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD比較或Dunnett T3

7、比較。以p<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.構建的三對shRNA表達載體分別為pGPU6/GFP/Neo-shRNA336、pGPU6/GFP/Neo-shRNA453及pGPU6/GFP/Neo-shRNA680，應用熒光定量PCR和Western blot檢測轉染人黑色素瘤A375細胞后靶基因RhoC mRNA和蛋白表達水平分別為1.47±0.26、1.13±0.16、1.39+0.11和70

8、.98±9.21、50.67±6.06、65.77±4.06，pGPU6/GFP/Neo-shRNA453為最有效干擾序列。
　　 2.成功構建了靶向RhoC的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體，經(jīng)測序證實序列正確；將構建的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體感染人黑色素瘤A375細胞，應用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC mRNA和蛋白的表達水平分別為1.05±0.05、62.

9、04±15.86，而陰性對照慢病毒組、正常對照組RhoC mRNA和蛋白分別為4.21±0.24、220.86±24.07和4.63±0.32、257.39±12.30，慢病毒表達載體組較對照組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.體外實驗中，將pLenti6.3-EGFP-453慢病毒載體感染人黑色素瘤A375細胞，應用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC基因沉默后轉移相關基因MMP-2mRNA

10、和蛋白的表達水平分別為1.17±0.16，66.40±14.51；而陰性對照慢病毒組、正常對照組MMP-2 mRNA和蛋白分別為2.28±0.31、112.59±23.27；2.75±0.90、135.88±26.16；pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。應用熒光定量PCR和Western blot檢測pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組E-cadherin mRNA和蛋

11、白的表達水平分別為2.95±0.71、125.17±19.88；而陰性對照慢病毒組、正常對照組E-cadherin mRNA和蛋白的表達水平分別為1.80±0.47、77.39±13.38；0.97±0.54、47.91±18.69；pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.體外實驗中，Transwell小室細胞侵襲實驗結果顯示：pLenti6.3-EGFP-453

12、慢病毒組穿膜細胞數(shù)為40.41±8.88，較陰性對照慢病毒組、正常對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陰性對照慢病毒組穿膜細胞數(shù)為64.82±13.48，正常對照組為77.46±6.47，陰性對照慢病毒組較正常對照組輕微下降，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結晶紫染色法細胞粘附實驗結果顯示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組A375細胞對層粘連蛋白(Ln)和纖維粘連蛋白(Fn)的粘附能力較慢病毒陰性對照

13、組、正常細胞對照組明顯下降，通過酶標儀測定光密度OD值，pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組對Ln和Fn的OD值分別為0.467±0.005、0.321±0.007，較陰性對照慢病毒組、正常對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陰性對照慢病毒組對Ln和Fn的OD值分別為0.532+0.005、0.376±0.004，正常細胞組分別為0.544±0.008、0.381±0.007，陰性對照慢病毒組較正常對照組輕微下降

14、，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 5.體外實驗中，MTT法檢測細胞增殖結果顯示：24h時間點pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組吸光度為0.319±0.004，與陰性對照慢病毒組、正常對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。72h、120h及168h時間點時，pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組吸光度分別為0.337±0.004、0.369±0.004和0.397±0.005；而陰性對照慢病

15、毒組、正常對照組吸光度分別為0.350±0.001、0.389±0.002、0.425±0.006和0.355±0.003、0.404±0.005、0.4404±0.010；pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組的細胞增殖較兩對照組下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 MTT法檢測pLenti6.3-EGFP-453慢病毒感染人黑色素瘤A375細胞后對DTIC耐藥性影響結果顯示：DTIC終濃度為0.01μg/m

16、l、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml時，慢病毒表達載體聯(lián)合藥物組抑制率分別為8.82％、14.01％、23.15％和33.51％；單獨藥物組抑制率分別為1.97％、7.79％、13.57％和20.37％，在單獨使用不同藥物濃度DTIC作用下，IC50值為254.99μg/ml，而聯(lián)合應用pLenti6.3-EGFP-453慢病毒和藥物DTIC作用下，IC50值下降為162.41μg/ml，逆轉倍數(shù)為1.57倍。流式細胞

17、術檢測細胞凋亡結果顯示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組細胞凋亡率為13.36±0.39％，與陰性對照慢病毒組、正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照慢病毒組細胞凋亡率為4.78±0.45％，正常對照組為3.98±0.41％，兩對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論：
　　 1.成功構建的靶向RhoC基因的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體可高效感染體外培

18、養(yǎng)的人黑色素瘤A375細胞，并可顯著抑制靶基因RhoC mRNA和蛋白的表達。
　　 2.pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體RhoC基因沉默后，可明顯下調(diào)體外培養(yǎng)的人黑色素瘤A375細胞的腫瘤轉移相關基因MMP-2表達，上調(diào)E-cadherin的表達。腫瘤細胞侵襲和粘附能力明顯抑制。RhoC基因沉默可能通過對腫瘤轉移相關基因的表達調(diào)控來實現(xiàn)對腫瘤侵襲轉移能力的抑制作用。
　　 3.pLenti6.3-EG