靶向Pim-3的雙功能載體對小鼠黑色素瘤的治療作用及機制研究.pdf

1、目的
　　黑色素瘤因其惡性程度極高而成為皮膚惡性腫瘤致死的主要原因之一，高發(fā)的侵襲和轉移是其最為顯著的特征和影響患者生存的首要因素。黑色素瘤的發(fā)病主要與紫外線的過度照射、環(huán)境因素、遺傳因素、外界刺激等因素相關，目前治療的主要方式包括手術、化療、放療和藥物治療，但預后較差，復發(fā)率高，病死率高。腫瘤細胞的無限生長和機體抗腫瘤免疫應答之間的相互作用是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因，為了有效激活機體抗腫瘤免疫應答，腫瘤免疫治療得到了廣泛的關注

2、和迅速發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤免疫原性高，通過對其進行免疫治療，增強機體抗腫瘤免疫應答，能有效的抑制腫瘤的生長，這也使得黑色素瘤的免疫治療得到迅速的發(fā)展。Pim-3作為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在多種癌癥中異常表達增加，主要通過磷酸化特異性底物使其失去活性，導致細胞凋亡減少、增殖增多，最終調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此Pim-3可能成為抗腫瘤治療的一個新靶點?；谝陨媳尘?，我們嘗試一方面利用具有免疫刺激作用的單鏈RNA（ssRNA）序列激活機體

3、TLR-7受體，進而誘導細胞因子的產(chǎn)生，活化免疫效應細胞，最終刺激機體抗腫瘤免疫應答，引起機體免疫系統(tǒng)對癌細胞的自主殺傷及清除;另一方面我們通過RNA干擾技術特異性沉默原癌基因Pim-3的表達，進而誘導腫瘤細胞凋亡，從腫瘤細胞本身出發(fā)抑制腫瘤的生長。結合以上兩方面的設想，我們構建了靶向沉默Pim-3的雙功能shRNA表達載體，該載體既能通過其包含的ssRNA片段活化TLR7受體激發(fā)機體抗腫瘤免疫應答，又能通過shRNA特異性沉默原癌基因

4、Pim-3的表達，促進腫瘤細胞的凋亡。本研究旨在觀察此雙功能表達載體對小鼠黑色素瘤的治療作用，并探討其可能的分子機制。
　　方法
　　1.以小鼠的黑色素瘤細胞系B16為主要研究對象，首先通過Western-blot檢測Pim-3在B16細胞、黑色素瘤組織及正常小鼠皮膚組織中的表達。
　　2.用脂質(zhì)體將pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA質(zhì)粒轉染到B16細胞中，通過qPCR

5、和Western-blot等方法檢測雙功能載體對Pim-3的沉默效果;通過ELISA檢測轉染后B16細胞中Ⅰ型干擾素的分泌，以確定TLR信號通路的活化。
　　3.用脂質(zhì)體轉染pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA質(zhì)粒到B16細胞中，24h后，通過AnnexinⅤ/PI染色和TUNEL免疫熒光技術檢測B16細胞的凋亡;通過Western-blot等方法檢測Bad、p-Bad、BCL-2、

6、BCL-XL等凋亡相關分子的表達。
　　4.通過劃痕、transwell實驗檢測B16細胞轉移和侵襲的變化;通過qPCR和Western-blot技術檢測EMT相關指標的變化。
　　5.通過Western-blot檢測STAT3、MAPK及NF-κB信號通路的活化情況，通過免疫共沉淀技術(Co-IP)檢測Pim-3與STAT3之間的結合，以探討Pim-3調(diào)控B16細胞侵襲轉移的機制。
　　6.對C57BL/6小鼠進行B

7、16細胞皮下荷瘤，待腫瘤長出后給予雙功能載體治療，觀察腫瘤生長情況，脾臟和腫瘤組織中各淋巴細胞的比例和活化情況。
　　7.給B16細胞轉染pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA質(zhì)粒后，通過尾靜脈注射轉染不同質(zhì)粒的B16細胞，建立黑色素瘤肺轉移模型，觀察不同載體治療對B16黑色素瘤細胞肺轉移的影響。
　　8.用清除抗體分別對C57BL/6小鼠NK、CD8+T和pDC細胞進行清除，再

8、對小鼠進行B16細胞皮下荷瘤，觀察在雙功能載體介導的抗腫瘤作用中，這三種細胞所發(fā)揮的作用。
　　9.進一步觀察pDC細胞清除后，雙功能載體的抗腫瘤作用及NK、CD8+T細胞的活化情況。
　　結果
　　1.Pim-3在正常小鼠皮膚中的表達極低，而在黑色素瘤細胞系中明顯高表達。
　　2.雙功能載體能有效沉默黑色素瘤細胞中Pim-3的表達，刺激Ⅰ型干擾素的分泌，引起TLR信號通路的活化。
　　3.用Pim-3-s

9、hRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA載體轉染B16細胞后，B16細胞的凋亡明顯增加。凋亡相關分子p-Bad、Bcl-2、Bcl-xl的表達明顯下調(diào)。
　　4.Pim-3-shRNA，尤其是ssRNA-Pim-3-shRNA表達質(zhì)粒，能明顯的抑制B16的轉移侵襲;進一步研究發(fā)現(xiàn)Pim-3的沉默主要通過抑制腫瘤細胞EMT過程的發(fā)生進而抑制腫瘤細胞的轉移侵襲過程。
　　5.ssRNA和ssRNA-Pim-3-shRNA促進

10、NF-κB信號通路的活化，而Pim-3-shRNA和ssRNA-Pim-3-shRNA沉默Pim-3抑制STAT3的磷酸化，且Co-IP結果顯示Pim-3和STAT3之間有明顯的結合。進一步研究發(fā)現(xiàn)沉默Pim-3可抑制STAT3的磷酸化，進而減弱EMT過程，抑制腫瘤的轉移侵襲。
　　6.雙功能載體可以顯著抑制B16皮下腫瘤的生長，同時能夠增加脾臟和腫瘤局部淋巴細胞中NK細胞和CD8+T細胞的比例和活化，并且增加pDC的比例。

11、>　　7.清除NK和CD8+T細胞均可明顯削弱雙功能載體治療對黑色素瘤生長的抑制作用。
　　8.清除pDC細胞明顯削弱雙功能載體對黑色素瘤的治療作用，NK、CD8+T細胞的比例和活化也減弱。
　　9.Pim-3-shRNA，尤其是ssRNA-Pim-3-shRNA表達質(zhì)粒，能明顯抑制黑色素瘤的肺轉移過程。
　　結論
　　1.靶向Pim-3的雙功能載體可以明顯促進黑色素瘤細胞的凋亡、抑制黑色素瘤細胞的增殖，并引起p