葡激酶模擬肽的研究.pdf

1、血栓栓塞是多種心血管疾病的主要發(fā)病原因之一。目前，已有多種溶栓制劑如組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)及其突變體等被用于治療血栓性疾病，它們能有效降低病人的致死率和致殘率。但是，目前的溶栓劑仍存在著再通不完全、初始再灌注延遲、血栓再形成、出血和過敏反應(yīng)等缺陷。葡激酶(Staphylokinase,Sak)具有與組織型纖溶酶原激活劑相當?shù)娜芩ɑ钚?，并有更高的纖維蛋白專一性，能以大腸桿菌為宿主通過基因工程菌大量

2、制備，是一種很有應(yīng)用前景的溶栓劑。現(xiàn)有主要溶栓劑t．PA、SK、UK、APSAC等均是靜脈注射用藥，不便于多次用藥，以及血栓性疾病的防治，臨床迫切需要預(yù)防血栓病的新藥。r-Sak分子量小，纖溶活性高，對富含血小板的陳舊性血栓的溶化效果明顯強于其他溶栓藥。 纖溶酶原(Plg)的激活過程在纖溶系統(tǒng)里是一個非常關(guān)鍵的反應(yīng)，它導(dǎo)致血栓的溶解，促進細胞遷移和組織重塑。最近，對uPlg和Sak以及Sk的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析為闡明細菌來源的纖溶酶

3、原激活劑的作用機制掃清了障礙。研究發(fā)現(xiàn)Sak和Sk作為輔因子與Plg的特定表位結(jié)合后，加強了后者與底物結(jié)合的能力，并且同時改變了Plm的底物特異性以及抑制物特異性。 近年來，基于結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計與基于功能的篩選進行生物大分子模擬肽研究倍受重視，并已取得令人鼓舞的成果。如美國加州Affymax研究所D0werWJ領(lǐng)導(dǎo)的小組應(yīng)用隨機肽庫親和篩選的方法，成功地將EPO(分子量34kD，166a.a.)縮小為20個殘基的環(huán)肽，仍具有EPO

4、的活性。比利時C01lenD小組應(yīng)用隨機肽庫研究了Sak突變體與P1g之間的相互作用，但國際上迄今未見從模擬肽水平研究兩者作用的報道。另一方面，許多蛋白酶由于參予生物體內(nèi)多種生理、病理過程，成為疾病研究和治療的靶點，結(jié)合噬菌體隨機肽庫，可以找到與某一特定蛋白酶相作用的多肽類配體，進而研究其作用機制，為新藥的開發(fā)提供先導(dǎo)化合物或直接作為抑制劑進入臨床前研究。 葡激酶(Staphylokinase，Sak)為金黃色葡萄球菌(Stap

5、hvlococcusaureus)溶原性噬菌體合成的一種蛋白質(zhì)，與纖溶酶原(Plasminogen，Plg)形成1：l的復(fù)合物Sak-Plg后，受血塊表面痕量纖溶酶Plm)催化，形成Sak-Plm，導(dǎo)致其中Plm的底物特異性改變，成為高效的纖溶酶原激活劑，激活另一分子Plg形成纖溶酶，催化纖維蛋白水解，使血栓溶解，血管再通。由于Sak本身并不是酶，它與Plg結(jié)合后改變Ph的底物特異性而發(fā)揮作用，同時，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌表達的Sak

6、形成包涵體，經(jīng)強變性劑如6M鹽酸胍或8M尿素溶解后，仍然有纖溶活性，這表明：Sak是一種輔因子(cofactor).在發(fā)揮纖溶活性時對結(jié)構(gòu)的要求并不嚴格，很可能只需要Sak分子中維持一定構(gòu)象的肽段或模擬肽，即可發(fā)揮Sak的功能；因此，我們以微小纖溶酶原(micro-Plasminogen，uplg)為靶分子，應(yīng)用隨機肽庫進行Sak模擬肽的篩選，再利用計算機輔助分子設(shè)計和結(jié)構(gòu)與功能信息處理，可望獲得模擬S狄功能的多肽類溶栓劑，不但可用于血

7、栓病的急救與預(yù)防，而且可能進一步發(fā)展為模擬肽和化學(xué)合成類的小分子溶栓防栓藥物。 利用絲狀噬菌體表面展示的隨機肽庫篩選與uPlg有高親和力的多肽，我們得到了“CSPDASRLC”和“ANQHHKHHHPHF”兩個序列，它們分別來源于由二硫鍵限制構(gòu)象的7肽庫和沒有構(gòu)象限制的12肽庫。對這兩個序列進行合成后分別測定其水解纖維蛋白的活性發(fā)現(xiàn)，二者僅顯示有微弱的活性，且前者的活性高于后者。在此基礎(chǔ)上，對序列“CSPDASRLC”進行結(jié)構(gòu)改

8、造，將該序列融合表達于水蛭素的32—36位1.00p區(qū)，由于野生型水蛭素的1.00p32-36伸展在水蛭素與凝血酶的作用面之外，是一個非常典型的β—Tum結(jié)構(gòu)，這使得該插入序列具有較好的溶液可及性，增加了該模擬肽的溶解性，進一步限制了分子自由度，提高了其構(gòu)象穩(wěn)定性，并且該序列的插入不影響水蛭素本身抑制凝血酶的活性。成為一類III型模擬肽分子。通過畢赤酵母表達系統(tǒng)，實現(xiàn)了該模擬肽的生物表達，純化后分別利用發(fā)色底物法和凝膠牛奶板溶圈法檢測其

9、水解纖維蛋白的活性，發(fā)現(xiàn)新的模擬肽分子具有較為明顯的溶栓活性，相比原來的從隨機肽庫直接篩選得到的多肽分子，新的Sak模擬肽的活性提高了約100一200 倍；并且由于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，大大提高了其生物利用度，可望在其基礎(chǔ)上通過結(jié)構(gòu)改造進一步提高其活性。 水蛭素(Himdin)是從水蛭中提取的一種抗凝血蛋白質(zhì)。1955年，M盯kwamt指出這種抗凝血物質(zhì)為蛋白質(zhì)，定名為水蛭素；1986年后基因重組水蛭素研究工作蓬勃開展，先后有瑞士C

10、iba—Geigy、德國Hoechst、法國Transgene公司的重組水蛭素問世。水蛭素含有65—66個氨基酸殘基，為單鏈蛋白結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)含3對二硫鍵。根據(jù)其N-端氨基酸及結(jié)構(gòu)差異可分為HVl、HV2、HV3等突變體類型。水蛭素與凝血酶結(jié)合比例為1：1，水蛭素分子有超過40％的結(jié)構(gòu)與凝血酶緊密結(jié)合，結(jié)合區(qū)域覆蓋了凝血酶分子中纖維蛋白原識別區(qū)及切割區(qū)(活性區(qū))，水蛭素N端致密區(qū)抑制凝血酶活性區(qū)，C端疏松區(qū)抑制凝血酶識別區(qū)，其凝血酶抑制常

11、數(shù)達10-11-10-14，抗凝活力極強。目前，國內(nèi)尚無此類產(chǎn)品，在國外已上市的有Hoechst公司的重組水蛭素產(chǎn)品(1epimdin，商品名Renudon，1997年德國HMR公司的重組水蛭素Renudan(R)(L印imdin)在歐洲獲準上市，98年5月獲得美國FDA批準)，用于治療對肝素過敏的患有肝素誘導(dǎo)血小板減少病癥(mT)的病人的抗血栓治療。另外，瑞士Novartis公司的重組水蛭素產(chǎn)品Desimdin在用于全髖置換術(shù)患者預(yù)防

12、血栓栓塞并發(fā)癥方面也有了確切的療效。臨床上，重組水蛭素多用于治療不穩(wěn)定性心絞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形術(shù)、術(shù)后血栓形成、血液透析、體外循環(huán)、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等。水蛭素及其突變體己經(jīng)在臨床得到應(yīng)用，臨床實驗表明水蛭素不引起過敏、免疫反應(yīng)，并且不會造成循環(huán)功能障礙。 由于水蛭素本身就是一種抗凝藥物，融合于水蛭素Loop32-36的Sak模擬肽因為不影響水蛭素與凝血酶的作用而兼有抗凝和溶栓兩種功能，可同時

13、從兩種途徑抑制體內(nèi)血栓的形成；此外，由于臨床實驗表明水蛭素不引起過敏、免疫反應(yīng)，該Sak模擬肽可望解決困擾Sak進入臨床用藥的免疫原性過高、易引發(fā)過敏反應(yīng)的問題。 該Sak模擬肽分子量約為野生型S狄的一半，可以通過畢赤酵母大量表達并純化；其分子結(jié)構(gòu)與Sak和Sk完全不同，證明了通過模擬Sak或Sk等細菌來源的纖溶酶原激活劑分子與Plg分子所形成的復(fù)合物特定部位的拓撲結(jié)構(gòu)，可以開發(fā)出新型的纖溶酶原激活劑作為新一代的溶栓和防栓藥物。