PTEN基因?qū)撬杌|(zhì)干細胞來源的神經(jīng)細胞中細胞骨架構(gòu)建的影響和意義.pdf

1、目的:
　　本實驗旨在研究在體外人工誘導成人骨髓基質(zhì)干細胞(BMSC)向有功能的神經(jīng)細胞分化的生物學過程中，第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因(PTEN)及其下游分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)共同調(diào)節(jié)細胞骨架構(gòu)建特征的變化，同時觀察和探討神經(jīng)細胞軸突標志性分子微管相關(guān)蛋白 tau(MAPT)分布特征及聚集方式，以及分析 MAPT與微絲之間的位置關(guān)系，并從機制上探討其在軸突長出過程中的意義。
　　方法:

2、r>　　實驗取材是從成人的松質(zhì)骨骨髓中分離出基質(zhì)干細胞，在體外經(jīng)多種既往證實有效的細胞因子對其誘導分化2周后，經(jīng)鑒定證實成為具有部分神經(jīng)功能的神經(jīng)樣細胞；應(yīng)用 PTEN抑制劑 BPV作用于該分化的細胞，用半定量RT-PCR方法研究 PTEN下游信號分子 mTOR的表達變化情況；應(yīng)用結(jié)合有綠色熒光劑的鬼筆環(huán)肽(Phalloidin-FITC)這一化學試劑染色細胞中的微絲肌動蛋白（F-actin），顯示細胞骨架構(gòu)建特征，在熒光顯微鏡下觀察細

3、胞突起內(nèi)細胞骨架構(gòu)建的變化特征及測量細胞突起長度。應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和western blot方法研究 MAPT的表達變化；用結(jié)合有熒光劑的鬼筆環(huán)肽化學試劑染色，直接使細胞中微絲肌動蛋白顯示綠色熒光，并聯(lián)合應(yīng)用免疫熒光細胞化學染色方法使軸突標志蛋白 MAPT顯示紅色熒光，完成雙重染色，進而可以在激光共聚焦顯微鏡下觀察 MAPT和肌動蛋白的定位特征及二者關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:
　　成人骨髓來源的基質(zhì)干

4、細胞在體外經(jīng)細胞因子誘導分化后，神經(jīng)細胞特征性標志分子 NSE和β-III tubulin表達水平增加，而神經(jīng)干細胞的標志物巢蛋白(nestin)表達先增加后減少(P<0.05)；經(jīng) BPV作用后 PTEN的下游分子mTOR的表達水平高于作用前(P<0.05)；細胞突起生長的長度從4.58±1.21μm增加到9.09±2.68μm(P<0.05)。成人骨髓來源的基質(zhì)干細胞在體外經(jīng)細胞因子誘導分化后，MAPT的mRNA在基質(zhì)干細胞向神經(jīng)細

5、胞分化1周和2周時相對的表達量水平為0.24±0.04和0.52±0.04，與作為對照組的BMSC中表達量水平0.04±0.02比較，表達數(shù)量上是逐漸上調(diào)的(P<0.05)。MAPT蛋白在分化1周和2周時的相對表達量水平分別為0.18±0.03和0.44±0.05，與對照組中表達量水平0.06±0.02比較也是逐漸上調(diào)的(P<0.05)。分化2周后的神經(jīng)樣細胞通過熒光染色后發(fā)現(xiàn)，經(jīng) PTEN抑制劑BPV作用后，MAPT軸突標志分子由彌散

6、分布狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，并和細胞微絲產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，并分布于神經(jīng)樣細胞一側(cè)，此細胞開始出現(xiàn)所謂細胞極化狀態(tài)。
　　結(jié)論:
　　在體外，骨髓基質(zhì)干細胞可以分化成為有功能的神經(jīng)樣細胞。而且BMSC來源的神經(jīng)細胞分化成熟時，PTEN/mTOR基因具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞及其突起內(nèi)部細胞骨架構(gòu)建的能力，PTEN參與調(diào)節(jié)細胞骨架中神經(jīng)細胞軸突標志性分子MAPT的表達、轉(zhuǎn)運和聚集分布過程，為神經(jīng)細胞的軸突進一步生長和發(fā)育成熟提供物質(zhì)支持，同時為神經(jīng)再