宮內發(fā)育遲緩新生大鼠胰腺發(fā)育相關轉錄因子的表達.pdf

1、目的：
　　宮內發(fā)育遲緩（Intrauterine growth retardation，IUGR）是指由于胎兒、母親或胎盤等各種不利因素導致胎兒在宮內生長模式偏離或低于其生長預期，即偏離了其遺傳潛能。通常是指新生兒出生體重小于同胎齡兒平均出生體重的第10個百分位或2SD的嬰兒。受雙親遺傳因素、孕婦營養(yǎng)狀況、地理環(huán)境、藥物、微量元素、子宮胎盤血流量、宮內感染等多種因素影響。宮內發(fā)育遲緩不僅會造成圍產期死亡率增加，目前研究表明宮內發(fā)

2、育遲緩者遠期并發(fā)癥（如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙及成年后患冠心病、高血壓病、糖尿病、腎病等）的危險度比正常出生體重兒明顯增加。
　　Hales和Barker提出的“節(jié)儉表型假說”，Lucas于1998年提出了“營養(yǎng)程序化(nutritional Programming)”的概念，用以闡述早期營養(yǎng)不良對成年期的持續(xù)影響，但詳細機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)宮內發(fā)育遲緩個體的胰腺β細胞發(fā)育受損，我們可以通過研究胰腺發(fā)育的相關轉錄因子表達情況，揭示宮內發(fā)

3、育遲緩個體胰腺發(fā)育受損的原因。
　　利用低蛋白飲食建立IUGR模型，研究胰腺發(fā)育的相關因子Pdx1、Nkx2.2、Nkx6.1和MafA在IUGR的表達情況，可以探究IUGR個體易發(fā)生Ⅱ型糖尿病的可能機制。
　　方法：
　　一、動物實驗
　　（一）實驗動物
　　清潔級Wistar大鼠18只，其中雄性3只，雌性15只，體重250～290g。
　?。ǘ嶒灧椒?br>　　1、動物模型制備
　　適應

4、性飼養(yǎng)7天后，雌雄鼠按5∶1比例合籠，次晨8:00-9:00時涂片，以鏡下見精子作為受孕第1天，孕鼠按受孕順序隨機分為低蛋白組和對照組，用孕鼠低蛋白飲食法建立IUGR模型。低蛋白組自妊娠第1天起給予低蛋白飼料（蛋白含量6％～8％）喂養(yǎng)，對照組給予標準飼料（蛋白含量18％）喂養(yǎng)直至自然分娩，飼料其余成分相同或相近，兩組飲水無限制。所有孕鼠均自然分娩，于娩出后12h內稱量新生大鼠體重，精確到0.01g，低蛋白組新生大鼠體重低于對照組新生大鼠

5、平均體重2個標準差的納入IUGR組。
　　2、標本取材
　　稱量低蛋白組及對照組新生大鼠體質量、鼻尾長，將符合IUGR標準的新生大鼠和對照組新生大鼠處死，顯微解剖鏡下完整分離胰腺，用分析天平稱量胰腺重量，迅速將胰腺置于4％多聚甲醛溶液中固定，準備做石蠟切片，準備進行HE染色和免疫組化。隨機挑選IUGR組和對照組新生大鼠各12只，處死前禁食6小時，心臟采血測定空腹血糖。腹腔注射葡萄糖2g/Kg體重，測定糖負荷后30分鐘、60分

6、鐘和120分鐘血糖值。
　　3、胰腺組織的鏡下觀察
　　4、免疫組織化學法檢測Nkx2.2和Nkx6.1的表達。
　　5、實時熒光定量PCR檢測Pdx1、MafA和Nkx6.1 mRNA的表達。
　　二、統(tǒng)計學方法
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以（x）±s表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗;以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　

7、一、低蛋白飲食組IUGR造模情況
　　低蛋白組新生大鼠體重，身長（鼻尾長）均顯著低于對照組(P＜0.05)低蛋白組。
　　二、IUGR組和對照組新生大鼠葡萄糖耐量實驗結果比較
　　IUGR組新生大鼠空腹血糖低于對照組(t=2.16，P＜0.05)，予以糖負荷后30分鐘、60分鐘差別無統(tǒng)計學意義，120分鐘時，血糖高于正常組。（t=5.438，P＜0.05）
　　三、IUGR組和對照組新生大鼠胰腺發(fā)育情況
　

8、　新生大鼠IUGR組HE染色后可看出胰腺形態(tài)較正常組松散，胰島數(shù)量減少，胰島面積減少。胰腺重量較對照組胰腺重量減少，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　四、IUGR組和對照組新生大鼠Nkx2.2表達情況的比較
　　Nkx2.2在胰島細胞的胞漿表達，部分腺泡上皮細胞的胞核表達，陽性反應部位呈棕黃色。IUGR組陽性反應部位的平均光密度，與對照組陽性反應部位平均光密度相比略有減低，但P＞0.05，無統(tǒng)計學意義。
　　Nkx2.2

9、在IUGR組陽性反應面積，與對照組陽性反應面積相比顯著降低，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。
　　五、IUGR組和對照組新生大鼠Nkx6.1表達情況的比較
　　Nkx6.1在胰島細胞的胞漿表達，陽性反應部位呈棕黃色，IUGR組陽性反應部位的平均光密度對照組陽性反應部位平均光密度相比顯著降低，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義。
　　NKx6.1在IUGR組陽性反應面積與對照組陽性反應面積相比顯著降低，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。<

10、br>　　六、IUGR組Pdx1、MafA、Nkx6.1mRNA相對表達量
　　RT-PCR結果顯示，IUGR組Pdx1 mRNA相對表達量低于對照組，P＜0.05，IUGR組MafA mRNA相對表達量低于對照組，P＜0.05，IUGR組Nkx6.1 mRNA相對表達量低于對照組(P＜0.01)，有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　宮內發(fā)育遲緩的新生大鼠胰腺中發(fā)育相關轉錄因子Pdx1、MafA和Nkx6.1的表達均有減低